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猪戊型肝炎（Swine Hepatitis E,SHE）是一种由猪戊型肝炎病毒（Swine Hepatitis E Virus,SHEV）感染引起的新型人畜共患传染病。开放读码框3（Open reading frame3,ORF3）是SHEV的关键调节和毒性蛋白。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种特殊的非编码RNA分子,具有封闭的环状结构,广泛存在于真核细胞中。研究表明circRNA分子中含有丰富的miRNA结合位点,可作为miRNA的分子海绵,竞争性的结合miRNA的靶标位点,降低靶基因与相应miRNA的结合,调控下游mRNA的表达水平;circRNA可通过与疾病相关的miRNA的相互作用,在疾病过程中发挥重要作用,为探讨SHEV ORF3影响靶细胞的作用机理,本课题进行了如下试验:1.SHEV ORF3基因过表达重组腺病毒的包装与感染基因Ⅳ型的SHEV ORF3基因片段由上海生工生物工程有限公司合成,编码区为345bp。根据GenBank公布序列设计上、下游引物,并分别设计EcoRI和BamHI为上、下游引物的酶切位点,通过多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）技术将Ⅳ型SHEV ORF3基因克隆至腺病毒穿梭质粒ADV4中,构建重组腺病毒穿梭质粒ADV4-SHEV-ORF3,与骨架质粒pGP-Ad-Pac Vector共转染HEK293A细胞,收集细胞与培养基,经反复冻融、离心获得重组腺病毒ADV4-ORF3与对照重组腺病毒ADV4-GFP;对重组腺病毒进行扩增,制备高滴度重组腺病毒ADV4-ORF3和ADV4-GFP,采用微量全细胞病变法对病毒滴度进行检测。将HepG2细胞按1×10~6个/孔铺板于12孔细胞培养板,按照感染复数（multiplicity of infection,MOI）=5:1分别加入重组腺病毒ADV4-ORF3和ADV4-GFP感染24h,使用倒置荧光显微镜检测GFP-ORF3融合蛋白的表达;针对ORF3基因序列,运用NCBI primer在线设计qRT-PCR引物,以GAPDH为内参,运用比较Ct值法,运用qRT-PCR检测GFP-ORF3融合蛋白mRNA水平的表达。结果:获取重组腺病毒ADV4-ORF3的滴度约为5×10~8PFU/m L;感染重组腺病毒ADV4-ORF3和ADV4-GFP的细胞基本呈现绿色荧光;qRT-PCR检测结果显示,在ADV4-ORF3感染组中,ORF3的相对表达量明显高于ADV4-GFP对照组,差异约1500倍,表明腺病毒成功介导了ORF3蛋白在HepG2细胞中的过表达。2.SHEV ORF3介导HepG2细胞差异表达circRNA的表达谱分析SHEV ORF3蛋白在HepG2细胞中成功过表达后,分别提取ADV4-ORF3和ADV4-GFP感染HepG2细胞的总RNA,利用高通量测序技术,分析差异表达circRNAs的表达谱;针对测序结果中,circRNA成环的反向剪切位点（back-splicing junction,BS）数目,top10的差异表达circRNAs,运用qRT-PCR进行验证;使用miRanda和Targetscan软件,分析circRNA-hosting基因;运用GO和KEGG,将差异表达的circRNA,进行功能富集性分析。结果:与ADV4-GFP感染组相比,在ADV4-ORF3感染组中,共鉴定出1105个表达上调和1556个表达下调的circRNAs,qRT-PCR结果证实,上调的hsa＿circ＿0001423、hsa＿circ＿0006404与下调的hsa＿circ＿0004833、hsa＿circ＿0007444同测序结果一致,表明高通量测序的数据可信;GO功能富集性分析表明,显著差异表达circRNAs的主要参与了细胞组分（cellular component）、生物过程（biological process）和分子功能（molecular function）;KEGG通路富集分析表明,显著差异表达的circRNAs主要参与了top20通路,其中,初步筛除出SHEV ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢（ko00740）通路相关显著差异表达的4个circRNA和1个mRNA,分别为circRNA13511,ciRNA140、hsa＿circ＿0130711、hsa＿circ＿0130715和ENST00000358229。结论:本研究首次利用腺病毒介导SHEV ORF3在HepG2细胞中的过表达,挖掘出1105个表达上调和1556个表达下调的circRNAs表达谱;并初步分析出SHEV ORF3影响HepG2细胞核黄素代谢相关显著差异表达的circRNA13511、ciRNA140、hsa＿circ＿0130711、hsa＿circ＿0130715和ENST00000358229,进而可能调控靶细胞脂质代谢的过程,为阐释SHEV ORF3蛋白的功能提供线索,也为进一步揭示SHEV感染的分子机制和防治SHE奠定基础。