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细胞间相互作用依赖于细胞间通讯和信号调控。除了细胞直接分泌化学信号、细胞间接触以及细胞间隙连接等通讯方式外,近年来的研究发现细胞释放的外泌体（exosomes）也是细胞间通讯的重要介质。Exosomes将源细胞（donor cells）的蛋白质、核酸、脂质等信息分子转移到受体细胞（receptor cells）中,从而实现对receptor cells生物学功能的调控。肿瘤微环境内的正常基质细胞摄取转移性肿瘤细胞源性exosomes后,可在donor cells信息调控下重编程向肿瘤前体细胞转化,表现出侵袭和迁移潜能,为肿瘤细胞迁移定植奠定基础。成纤维细胞是肿瘤微环境中一类重要的基质细胞,可通过向肿瘤前体细胞的转化协助肿瘤细胞的迁移定植。本课题组前期的研究揭示小鼠黑色素瘤B16-F10细胞exosomes可诱导小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）表达侵袭性特征,表明黑色素瘤细胞exosomes有促进成纤维细胞向肿瘤前体细胞转化的可能性。Ras 相关的 C3 肉毒素底物 1（ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1）蛋白是细胞内信息调控的重要分子,在肿瘤细胞的侵袭和迁移过程中扮演着重要角色,主要是依赖其表达水平高低及其在细胞内的不同分布实现细胞骨架重组,促进片状脂膜和丝状伪足的伸展,促使细胞发生侵袭和迁移。本文以小鼠黑色素瘤B16-F10细胞和小鼠胚胎成纤维MEF细胞为材料,研究B16-F10细胞exosomes对MEF细胞迁移能力的影响及其机制,进一步验证黑色素瘤细胞exosomes促进成纤维细胞向肿瘤前体细胞转化的可能性,为诠释肿瘤细胞侵袭和迁移的机制提供一种新思路。研究目的1.建立B16-F10细胞exosomes与MEF细胞共培养体系,分析B16-F10细胞exosomes对MEF细胞迁移能力的影响,提供转移性肿瘤细胞exosomes影响成纤维细胞向肿瘤前体细胞转化的证据。2.在建立的B16-F10细胞exosomes促进MEF细胞迁移的共培养体系基础上,分析B16-F10细胞exosome影响MEF细胞的Rac1蛋白表达水平及其在细胞内不同分布,诠释转移性肿瘤细胞exosomes促进成纤维细胞迁移的部分机制。研究方法1.以小鼠高转移细胞株B16-F10细胞和原代MEF细胞为研究对象,超高速离心的方法获取B16-F10细胞exosomes,通过透射电镜负染色观察exosomes的典型形态,纳米颗粒跟踪分析（Nonoparticle tracking analysis,NTA）检测 exosomes 的大小分布,Western-blot鉴定标志蛋白酪氨酸相关蛋白2（Tyrosinase related protein 2,Tyrp2）和肿瘤易感基因 101（Tumor susceptibility gene101,Tsg101）。2.建立B16-F10细胞exosomes与MEF细胞的共培养体系,分别设置0 h、12 h、24 h、36 h组别。采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分别检测MEF细胞体外摄取PKH26标记的B16-F10细胞exosomes的能力。以MEF细胞组为对照组,通过transwell实验确定B16-F10细胞exosomes对MEF细胞迁移的影响,并通过Western-blot实验检测共培养体系内B16-F10细胞exosomes影响MEF细胞表达E-caderhin蛋白水平。3.在建立的共培养体系及分组基础上,通过RT-PCR实验检测B16-F10细胞exosomes影响MEF细胞的Rac1 mRNA的转录水平。通过Western-blot实验检测B16-F10细胞exosomes影响MEF细胞表达Rac1蛋白水平,并通过细胞免疫荧光染色实验检测B16-F10细胞exosomes影响MEF细胞表达Rac1蛋白水平及其在细胞内的不同分布情况。研究结果1.超高速离心获得的B16-F10细胞exosomes呈现典型的茶托状形态,粒径大小分布在164 nm～255 nm之间,并表达黑色素瘤特征蛋白Tyrp2和exosomes特征蛋白 Tsg101。2.B16-F10细胞exosomes与MEF细胞共培养0 h,MEF细胞内没有PKH26标记的exosomes,共培养12 h,有少量的B16-F10细胞exosomes聚集在MEF细胞的胞质边缘,共培养24 h,36 h,有大量的exosomes聚集在MEF细胞的胞质内及细胞核周边。且相比于共培养0 h,共培养12 h、24 h、36 h的MEF细胞对PKH26标记的exosomes的摄取率显著增加（P<0.01）。通过迁移实验结果表明,相比于共培养0h,共培养12h、24h、36h的MEF细胞的迁移能力显著增加（P<0.01）,与此同时,MEF细胞表达E-caderhin蛋白水平显著下降（P<0.05,P<0.01）。3.在B16-F10细胞exosomes促进MEF细胞迁移的共培养体系内,与共培养0 h相比,共培养24 h的MEF细胞的Rac1 mRNA转录水平显著增加（P<0.01）,且共培养24 h、36 h的MEF细胞Rac1蛋白表达水平逐渐增加的趋势（P<0.05,P<0.01）。与此同时,Rac1蛋白表达出现时序性位置变化,依次MEF细胞的细胞膜、细胞质、细胞核出现不同程度的分布。研究结论1.通过建立小鼠黑色素瘤B16-F10细胞exosomes与MEF细胞的共培养体系,确定了 B16-F10细胞exosomes体外促进MEF细胞的迁移能力,提示转移性肿瘤细胞通过转运exosomes影响成纤维细胞向肿瘤前体细胞转化。2.在B16-F10细胞exosomes体外促进MEF细胞迁移能力的共培养体系基础上,确定MEF细胞摄取B16-10细胞exosomes后促进Rac1蛋白表达水平,且Rac1蛋白的表达位置出现时序性变化,依次在MEF细胞的质膜、胞质、细胞核出现不同程度的分布,表明B16-F10细胞exosomes通过调节Rac1蛋白的表达水平及其在细胞内的不同分布促进MEF细胞的迁移。