牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)是一种非分节的单股负链RNA病毒,在世界分布广泛,是引起牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的重要病原。BPIV3感染牛症状各异,轻者出现咳嗽发热等症状,严重的会引起继发的细菌感染,导致支气管细胞坏死,出现肺炎等状况。该病的广泛存在严重制约养牛产业的进一步发展,对养牛业的经济与发展造成了严重的损失。基于目前国内对BPIV3的研究较少,还没有商品化BPIV3检测试剂盒,国外虽有检测试剂盒,但检测成本较高。因此,建立一种具有自主知识产权的BPIV3血清学检测方法至关重要。另一方面,对BPIV3感染的研究离不开机制机理的研究,而检测BPIV3机理及基因功能的研究,需要定量检测蛋白的表达,但缺乏相应抗体。据报道,BPIV3的N蛋白是病毒核衣壳的主要成分,具有良好的免疫原性,可以用来制备检测抗体。因此本项目主要从三个方面进行研究。首先,进行N蛋白原核表达载体的构建与N蛋白的表达纯化。根据文献报道与对N基因生物信息学分析,本实验克隆了编码N蛋白388 aa~500 aa优势抗原区域基因,成功构建pET-32a-N原核表达载体,转化并获得重组表达截短的N蛋白的基因工程菌株。当IPTG浓度为1 mM,诱导时间为8 h的条件下该蛋白表达量较高,并主要以可溶性形式表达。纯化时采用Ni-NTA亲和层析方法,当用NPI 70溶液洗脱时蛋白纯化较好,成功制备浓度约为0.6 mg/mL的N蛋白。其次,制备N蛋白多克隆抗体。将制备的截短表达的N蛋白与弗氏佐剂1:1混合后免疫昆明小鼠,初次免疫后进行两次加强免疫,采取小鼠血液吸取血清。用该血清为一抗通过Western Blotting检测接种和未接种BPIV3的MDBK细胞样本,相较于未接种的细胞,该抗体与接种病毒细胞样本在约70 KDa左右处出现特异条带,与预期的N蛋白分子量一致,表明该多克隆抗体可作为Western Blotting抗体,用于BPIV3基础理论研究中N蛋白表达的检测。最后,建立可用来检测BPIV3的ELISA检测方法。经反复实验确定的优化条件为:抗原包被浓度1.4μg/mL,37℃包被2 h;10%马血清37℃封闭1.5 h;1:50稀释血清,37℃孵育1 h;1:2000稀释二抗,37℃孵育1 h;TMB显色15 min。重复性和特异性实验表明,该ELISA检测方法重复性好、特异性强,可用作BPIV3的初步检测。利用所建立的方法检测牛血清,与进口试剂盒相比较,总符合率为90.2%。用该方法检测来自天津的牛血清,阳性率达55.3%,该牛场BPIV3防控形势严峻。本研究原核表达、纯化了BPIV3 N蛋白,用其制备的多克隆抗体可为BPIV3基础理论研究中Western Blotting检测N蛋白表达时提供支持;利用N蛋白建立的ELISA检测方法,可初步用作BPIV3的检测,在一定程度上可降低检测成本,并为检测试剂盒的开发铺设条件。