虾蟹及鱼类等甲壳类水产品是FAO统计的八大类食物过敏原之一。近年来,随着海产品的消费量越来越多,海产品等食物过敏现象越来越严重,对人们的身体健康安全造成了很大威胁,引起了各国人们的广泛关注,越来越多的学者致力于脱敏以及过敏机理的研究。随着过敏机理研究的深入,对过敏原表位的研究也越来越多。研究发现加热、辐照等可以降低虾的免疫原性,但目前对加工方式脱敏的研究主要是对虾致敏蛋白本身,而对过敏原表位的影响研究还比较少,同时,过敏原表位中氨基酸序列中关键氨基酸也不清楚。探讨脱敏方法对抗原表位的影响,以及表位氨基酸的分析等对过敏原脱敏机理研究和及生产低敏食品都具有重要的理论意义。本文对虾过敏原Pen al进行提取纯化后,对其进行加热、辐照及加热与辐照综合处理,利用制备的Pen al抗体及五种表位抗体进行检测,分析不同处理方式对Pen al致敏性的影响以及Pena1中五个抗原表位在不同处理方式下免疫原性的变化。今通过对表位中氨基酸用丙氨酸替换的方法研究表位中关键氨基酸。具体研究内容及结果如下：(1) Pen al蛋白提取纯化及多克隆抗体的制备。采用KC1抽提液对虾蛋白抽提,并采用等电点沉淀,硫酸铵分级沉淀,凝胶层析等方法纯化得到Pen al。用此纯化的Pen al作为免疫原对新西兰纯种大白兔进行免疫,制备多克隆抗体血清,其效价达到8.92×108。(2) Pen al加热及辐照处理,western-blot及Ci-ELISA方法检测免疫原性变化。对提取纯化的Pen al进行不同时间加热处理(0、5、15、30min)不同剂量γ射线辐照处理(0、7、10kGy)；加热与辐照综合处理(5min,7kGy等12种处理)。Western-blot方法及Ci-ELISA检测结果表明,单独加热处理并不能降低Pen al的免疫原性,反而随着加热时间的延长,免疫原性略微增加;7kGy辐照处理也不能降低Pen al免疫原性,10kGy辐照处理能够降低其免疫原性,且7kGy辐照与加热综合作用时,脱敏效果更明显。对表位免疫原性分析发现,epitope1,2,4对辐照及加热处理较敏感,并使其免疫原性增大。epitope3变化情况与Pen al全蛋白的变化类似,即在辐照处理之后,免疫原性降低,并且在辐照与加热综合作用时,免疫原性降低程度更大,epitope5IC50值变化不大,说明epitope5对辐照及加热处理方法均较稳定,可以用于免疫试剂盒的研制。(3)突变表位肽的设计合成及致敏性测定。对Pen al中5个抗原表位进行氨基酸出现频率分析及保守性分析,筛选出表位区域中具有较高几率可能为关键氨基酸的氨基酸,将其突变为丙氨酸,采用Fmoc固相合成法合成突变表位肽。利用表位抗体,通过免疫竞争斑点法及间接ELISA方法检测突变肽的免疫原性。根据突变后表位区域的致敏活性来判断该氨基酸是否为关键氨基酸。实验结果推断epitope1表位的关键氨基酸为谷氨酰胺；epitope2表位的关键氨基酸为亮氨酸和谷氨酸；epitope3表位的关键氨基酸为亮氨酸和天冬氨酸；epitope4表位的关键氨基酸为缬氨酸,亮氨酸和谷氨酸；epitope5表位的关键氨基酸为亮氨酸。综上,本文提纯了Pen al,探究了加热及辐照对Pen al免疫原性的影响,及其抗原表位免疫原性的影响,证实了加热及辐照综合作用能够显著降低Pen al的免疫原性。同时,通过对五个抗原表位中的氨基酸分析,并替换为丙氨酸的方法,筛选出了各表位的关键氨基酸,为过敏机理的研究及脱敏食品的开发提供了理论依据。