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目的:建立HSV-tk的相关真核表达载体,通过脂质体将重组质粒转染入肿瘤细胞后,研究人端粒酶逆转录酶( hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法:1.利用重组DNA技术,以pGL3- hTERT/tk为基础,构建pGL3-hTERT/luc、pGL3-basic/tk(阴性对照)、pGL3-control/tk(阳性对照)等真核表达载体,并转入JM109进行酶切鉴定;2.将序列正确的载体大量纯化扩增后,通过脂质体法转染肝癌细胞(HepG2)和正常肝细胞(L02),然后用不同浓度的G418筛选阳性克隆细胞,提取阳性克隆细胞的RNA,并进行RT-PCR鉴定;3.用荧光显微镜检测hTERT启动子的活性;4.给予前药更昔洛韦(GCV),用原位末端标记(TUNEL)法、流式细胞仪检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞进行细胞凋亡和细胞周期分析;5.Western blot检测细胞周期素cyclinD1、CDK2、P21的蛋白表达。结果:1.构建的三组质粒经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后,所得基因片断与预期基因片断大小相符;2.通过脂质体转染法将pGL3- hTERT/tk转入HepG2细胞后,筛选出了抗高浓度(900μg/ml)G418的阳性克隆,并用RT-PCR法进行了鉴定;3.通过荧光显微镜发现:hTERT启动子调控的luc基因可在肿瘤细胞中特异性表达,而SV40启动子调控的则没有肿瘤特异性;4.给予前药更昔洛韦(GCV)后,原位末端标记(TUNEL)法显示,阴性对照组肿瘤细胞胞浆被染成蓝色;而pGL3- hTERT/tk组细胞密度明显变低,大部分细胞核被染成棕黄色;流式细胞仪检测: pGL3- hTERT/tk(hepG2/tk)在HepG2细胞的凋亡率明显高于pGL3-basic/tk组,但却低于pGL3-control/tk组,差异有统计学意义(P<0.05);而在正常肝细胞L02中, pGL3-control/tk凋亡率最高,与前两者比较,差异有统计学意义(p<0.05)。从S期细胞所占总细胞比例来看,hepG2/tk细胞明显少于对照细胞,差异具有统计学意义(P<0.05),提示pGL3- Htert-tk/GCV系统对细胞DNA的合成和复制有影响;5. Western blot也显示cyclinD1、CDK2蛋白表达下降而P21升高。结论:成功构建了TK的相关真核表达载体,并用脂质体转染法将其转入HepG2肿瘤细胞,可促使肿瘤细胞发生凋亡、细胞周期相关蛋白表达情况改变,从而证实hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题。