论文部分内容阅读
血管内皮细胞(VEC)的增殖调控在血管生成、肿瘤发生以及创伤后组织修复等过程中具有重要意义。分化抑制因子(inhibitor of differentiation，Id)蛋白在血管内皮增殖调控中发挥重要作用。Id蛋白和bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子结合形成无DNA结合功能的异二聚体，后者抑制了细胞增殖和分化相关基因的转录活性，从而达到抑制细胞分化和促进细胞增殖的目的。1999年Nature杂志评价Id蛋白为调控细胞分化的刹车(brake)，Id蛋白相关的信号转导途径的研究具有重要意义。hCASK(human calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase)基因于1997年被发现，CASK属于膜相关鸟氨酸激酶 (membrane-associated guanylate kinase，MAGUK)，为细胞支架蛋白(scaffolding protein)。2000年，我室首次在酵母中发现hCASK的GUK 结构域与人Id1 发生特异的结合，为我们研究CASK的功能及下游信号途径提供了新的思路。实验目的：1. 进一步在人血管内皮细胞中证实CASK和Id1结合，为研究CASK和Id1的信号途径奠定基础。 2. 探讨CASK-Id1的生物学效应。3. 探讨胞外信号bFGF与CASK-Id1通路的关系及其效应机制。材料和方法：1. 原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离和培养：用0.25％胰酶消化新生胎儿脐静脉10分钟，离心收集消化液中的人脐静脉内皮细胞，加入 M199培养基(含10％FCS)，于37℃、5％CO2 孵箱培养。2. 人脐静脉内皮细胞株ECV304和稳定转染人CASK全长的ECV304细胞(IPTG诱导表达)，细胞培养方法同上。 3. 免疫共沉淀实验：用CASK抗体与ECV304细胞和原代HUVEC裂解液孵育后，IgG-CASK免疫复合物及其结合蛋白被琼脂糖颗粒(Agarose)共沉淀，将所得的沉淀行蛋白质免疫印迹(western blotting)，用Id1抗体检测Id1的存在。 4. 激光共聚焦实<WP=9>验：不同的荧光标记抗体检测CASK和Id1，激光共聚焦显微镜下观察原代HUVEC中CASK和Id1的细胞亚定位。 5. bFGF和反义寡核苷酸作用ECV304细胞CASK和Id1的表达情况 (western blotting)： ECV304细胞经血清饥饿6h，用不同浓度的bFGF刺激细胞8h，观察在在不同浓度bFGF刺激下CASK和Id1的表达情况；检测IPTG诱导CASK表达以及反义寡核苷酸阻断CASK和Id1表达情况。 6. RT-PCR：IPTG诱导CASK表达后，ECV304细胞中p53 mRNA表达量的变化。 7. 凝胶迁移率电泳实验(EMSA)：IPTG诱导CASK在ECV304细胞过量表达后，EMSA观察不同时相点，p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子的结合情况；广谱性的bHLH转录因子E12/E47抗体阻滞迁移率实验，观察该转录因子是否参与了E-box的结合；Id1经反义寡核苷酸阻断后，观察p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子的结合情况；不同浓度bFGF刺激ECV304细胞后，观察p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子的结合情况。实验结果：1. CASK与Id1在人内皮细胞中的特异性结合：1) 免疫共沉淀实验证实了ECV304细胞、原代HUVEC中存在着CASK和 Id1的天然结合。2) 激光共聚焦实验结果表明：原代HUVEC中可见CASK和Id1在胞浆近核膜处结合形成颗粒状复合物。2. bFGF以及反义寡核苷酸处理对ECV304细胞表达CASK与Id1的影响：western blotting结果显示：IPTG诱导后，CASK表达明显增加；Id1反义寡核苷酸处理后，Id1表达明显下调，而CASK反义寡核苷酸不能阻断内源性的CASK表达；bFGF刺激ECV304细胞与CASK生成存在着量效关系： 100，200，400 ng/ml的bFGF浓度刺激，CASK表达量无差异，而600 ng/ml以上的浓度刺激后CASK表达量增加；不同浓度的bFGF刺激ECV304细胞，Id1的表达量基本一致。3. CASK-Id1通路对p53 mRNA转录的调节：<WP=10>1) CASK上调p53 mRNA的表达RT-PCR结果显示： IPTG诱导8h后,ECV304细胞中p53 mRNA的表达即增加，12h达到高峰，以后逐渐下降，48 h已基本恢复正常。2) CASK通过Id1调节p53启动子E-box与相关bHLH转录因子的结合EMSA结果显示：IPTG诱导CASK在ECV304细胞表达6h后，p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子的结合活性增强，8h达到峰值，24 h基本恢复正常；Id1反义寡核苷酸阻断Id1表达后，该 E-box与相关bHLH转录因子结合活性也增加，现象与CASK的调节作用一致；IPTG诱导表达CASK的同时，用Id1反义寡核苷酸阻断Id1表达，出现了“叠加效应”，即E-box与相关bHLH转录因子结合活性比上述单因素作用效应更强；抗体阻滞迁移率实验表明广谱性的bHLH转录因子E12/E47 未参与该p53启动子中E-box的结合。3) bFGF调节p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子结合活性不同浓度的bFGF(100，200，400，600，800，1,000ng/ml)作用 ECV304细胞，p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子结合活性呈波动性变化：bFGF的浓度为400ng/ml时，结合活性最弱，低于正常对照；大于600 ng/ml bFGF的浓度作用后，结合活性明显增大。实验结论1．人血管内皮细胞中存在着天然的CASK和Id1的相互作用。2．CASK能上调p53 mRNA的表达。3．CASK-Id1通路可能通过调控p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子的结合调节p53 mRNA转录，该转录因子可能是某一血管内皮细胞特有的bHLH转录因子。4．大于600ng/ml 高浓度的bFGF刺激ECV304细胞，CASK的蛋白