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研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),属于苯丙胺类兴奋剂,是一种在麻黄素化学结构基础上衍生而来的物质,故又称去氧麻黄素,因外观为纯白色晶体,又俗称“冰毒”。1919年,日本化学家A.Ogata首次合成晶体状的甲基苯丙胺,使其大规模的生产成为可能;1945年,确定甲基苯丙胺可滥用成瘾;1951年,日本开始对甲基苯丙胺进行管制。二十世纪末,以甲基苯丙胺为代表的新型毒品由于其生产和加工相对简单,吸食毒品的成品更为低廉,已逐步替代以罂粟为主要原料的传统毒品并迅速在世界各国蔓延。根据我国食品药品监督管理总局(CDFA)发布的《国家药物滥用监测年度报告(2016)》,2016年药物滥用监测276,980例(份),海洛因滥用监测数据占全部监测数据的45.0%,同比2015年下降3.6个百分点,近五年呈持续下降趋势;含甲基苯丙胺的毒品(“冰毒”、“麻谷丸”)滥用所占比例55.1%,同比2015年度增加3.2个百分点,是我国流行滥用的主要合成毒品,这表明以海洛因为代表的传统毒品快速蔓延势头得到进一步遏制,而以甲基苯丙胺为主的新型合成毒品滥用人员增长迅速,我国毒品形势依然不容乐观。甲基苯丙胺长期滥用可引起各类刑事犯罪,给社会的治安带来极大危害,因此,对METH的毒性及其防治的研究已经成为世界面临的重大课题和研究热点。METH的分子量为149.233,分子式为C10H15N,结构式为其化学结构与麻黄素、儿茶酚胺类递质结构极其类似,因此其药理学特性包括中枢神经兴奋性、致幻作用,同时还通过中枢及外周神经末梢释放大量的儿茶酚胺类物质,引起血管收缩、心跳加快和血压升高等拟交感神经效应。从流行病学调查总结的大量临床资料得出,METH可引起心、脑、肺、肝、肾等体内重要实质器官的损害;在对众多器官的损伤中,对中枢神经系统的毒性损伤最大、是研究最深入的;而近年来,越来越多的研究显示,METH对心血管系统也造成较大影响,甚至是致死性的损害。2017年,有伊朗病理学家研究了 100例甲基苯丙胺中毒相关死亡病例,在所有案例中,法医确定甲基苯丙胺毒性是其直接致死原因,而其中68%的研究病例发现心血管病理改变。METH所致心血管损伤中,主动脉瘤/夹层的发病率呈逐年上升趋势,病情凶险,且致残率和猝死率较高,1994年,报导7例由于滥用METH猝死的案例,其中4例动脉瘤,3例主动脉夹层;1999年,报导84例由于滥用毒物导致主动脉夹层破裂死亡的病例,其中35例为单独使用METH;2007年,对109例主动脉夹层病例进行分析,发现≦50岁的未有相关基础疾病的病人与吸食METH密切相关,随着大量的案例报道发表,目前认为METH是继高血压后导致主动脉瘤/夹层发生的第二大危险因素。根据国内外研究发现,TGF-β、MMPs、白介素、前列腺素、RhoA、microRNA等参与主动脉瘤/夹层的形成与发展,microRNA(miRNA或miR),是一种长度约为20-23个核苷酸的一类非编码小RNA;据推测,其参与体内近三分之一的基因表达的调控;主要通过与靶基因的不完全互补配对而在转录及转录后水平上对靶基因的表达进行负调控,导致mRNA的降解或翻译抑制。目的:明确microRNA介导血管平滑肌细胞(VSMCs)的凋亡与自噬在METH诱导的大鼠主动脉瘤/夹层中的作用及可能调控机制。方法:第一部分 1.0mmol/L METH 处理 VSMCs 24h后进 microRNA 芯片筛查及体内、体外QPCR验证(1)分离培养150-200g左右的雄性SD大鼠的血管平滑肌细胞;(2)实验分组:control 组,METH 处理组(1.Ommol/LMETH 作用 24h)Trizol处理后收集细胞,送至上海伯豪生物技术有限公司进行microRNA芯片筛查;(3)按照 P<0.05 及 Fold change≥2 或者≤0.6 选择待验证 microRNAs;(4)QPCR 检测 METH 处理后 VSMCsmiR-351-5p、miR-20b-5p、miR-708-5p的表达变化;(5)METH诱导的主动脉瘤/夹层动物模型分组:control组、BAPN+METH-组、BAPN-METH+组、BAPN+METH+组;(6)QPCR 检测主动脉瘤/夹层中 miR-351-5p、miR-20b-5p、miR-708-5p 的表达变化;(7)根据体外、体内验证结果选取研究目的microRNAs。第二部分 miR-351-5p在METH诱导的VSMCs自噬中的作用、靶标及在METH诱导的主动脉瘤/夹层模型中的作用(1)实验分组:NC组、miR-mimics 组、NC+METH 组、miR-mimics+METH组;(2)QPCR 检测 miR-351-5p mimics AGGCUCAAAGGGCUCCUCAGGGA UU过表达效率;(3)Western-blot检测过表达miR-351-5p对METH诱导的VSMCs自噬中的作用;(4)转染GFP-LC3检测过表达miR-351-5p对METH诱导的VSMCs自噬中的作用;(5)透射电镜检测过表达miR-351-5p对METH诱导的VSMCs自噬中的作用;(6)生物信息学软件预测miR-351-5p作用靶标;(7)Western-blot 检测过表达 miR-351-5p 对 METH 诱导的 VSMCs 中UVRAG表达的影响;(8)实验分组:NC 组,siUVRAG#1组,siUVRAG#2 组,siUVRAG#3 组siUVRAG#4 组,METH组,siUVRAG#1+METH 组,siUVRAG#2+METH组,siUVRAG#3+METH组,siUVRAG#4+METH组;#1 GGAACAUUGCUGCUCGGAATTUUCCGAGCAGCAAUGUUCCTT#2GGAGUGAAGUGAUUAAGAATTUUCUUAAUCACUUCACUCCTT#3GCUGUUGAUAGAGUGGAAATTUUUCCACUCUAUCAACAGCTT#4GCAACAAAUGGCUCUACAATTUUGUAGACCCAUUUGUUGCTT(9)Western-blot检测沉默UVRAG基因对METH诱导的VSMCs自噬的影响;(10)Western-blot 检测过表达 miR-351-5p 对 METH 诱导的 VSMCs 中STAT3表达的影响;(11)Western-blot 检测过表达 miR-351-5p 对 METH 诱导的 VSMCs 中Tyr-STAT3、Ser-STAT3、LCN2 表达的影响;(12)实验分组:Control 组、METH 组、Stattic 1um、3um、5um、7um、1Oum 组;(13)Western-blot检测抑制Tyr-STAT3表达对METH诱导的LCN2表达及自噬的影响;(14)实验分组:NC 组、siLCN2 组、NC+METH 组、siLCN2+METH 组;SiLCN2:CCCAGGACUCAACUCAGAATTUUCUGAGUUGAGUCCUGGGT T(15)Western-blot检测沉默LCN2对METH诱导的自噬的影响;(16)Western-blot检测METH诱导的主动脉瘤/夹层血管组织中UVRAG、STAT3的表达;(17)Western-blot检测METH诱导的主动脉瘤/夹层血管组织中自噬marker的表达。第三部分miR-20b-5p在METH诱导的VSMCs自噬中的作用、靶标及在METH诱导的主动脉瘤/夹层模型中的作用(1)实验分组:NC 组、miR-mimics 组、NC+METH 组、miR-mimics+METH组;(2)QPCR 检测 miR-20b-5p mimics ACCUGCACUAUGAGCACUUUGUU过表达效率;(3)Western-blot检测过表达miR-20b-5p对METH诱导的VSMCs凋亡中的作用;(4)生物信息学软件预测miR-20b-5p作用靶标;(5)Western-blot 检测过表达 miR-20b-5p 对 METH 诱导的 VSMCs 中 PTEN表达的影响;(6)Western-blot检测过表达miR-20b-5p对 METH诱导的 VSMCs 中 CHOP表达的影响(7)实验分组:NC 组,SiPTEN#1 组,SiPTEN#2 组,METH 组,SiPTEN#1+METH 组,SiPTEN#2+METH 组;(8)Western-blot检测沉默PTEN基因对METH诱导的VSMCs凋亡的影响;(9)Western-blot检测METH诱导的主动脉瘤/夹层血管组织中PTEN的表达;(10)Western-blot检测METH诱导的主动脉瘤/夹层血管组织中凋亡marker的表达。结果:第一部分 1.Ommol/LMETH处理VSMCs24h后进行芯片筛查及体内、体外 QPCR验证(1)1.Ommol METH处理VSMCs 24h后进行芯片筛查,结果表明共61个microRNAs 出现了表达变化,其中 METH 组较 Control 组 miR-351-5p、miR-20b-5p下降明显,miR-708-5p上升明显。(2)体外实验验证同芯片趋势一致,miR-351-5p与miR-20b-5p显著下降;miR-708-5p上升显著;(3)体内实验验证,BAPN-METH+组较 control 组 miR-351-5p、miR-20b-5p 有所下降、BAPN+METH+组较 control 组 miR-351-5p、miR-20b-5p 显著下降;BAPN-METH+组与 BAPN+METH+组 miR-708-5p 均有一定程度升高。(4)选定 miR-351-5p 与 miR-20b-5p 为研究目的 microRNAs。第二部分miR-351-5p在METH诱导的METH诱导的主动脉瘤/夹层中的作用及机制初探(1)合成的miR-351-5p mimics能够有效的在细胞中过表达:1.0mmol/L METH处理VSMCs 24h后,NC+METH组较NC组显著下降,过表达miR-351-5p后较NC组迅速上升,升高显著具有统计学差异。(2)过表达miR-351-5p对METH诱导的VSMCs自噬有保护作用:①Western-blot检测自噬marker基因:NC+METH组较NC组自噬现象明显,marker 基因 beclin-1、LC3-Ⅱ表达显著升高,过表达 miR-351-5p 后,Beclin-1、LC3-Ⅱ表达量随之下降,趋势明显具有统计学差异;②转染GFP-LC3检测LC3-Ⅱ聚集程度:NC+METH组较NC组细胞内绿色明亮斑点明显增多,LC3-Ⅱ大量聚集,过表达miR-351-5p后,绿色斑点数量迅速下降,细胞荧光亮度明显减弱具有统计学差异;③透射电镜检测自噬小体数量:NC+METH组较NC组细胞内自噬小体数量明显增多,细胞自噬现象明显,过表达miR-351-5p后,自噬小体量迅速下降,自噬小体数量明显减少具有统计学差异;(3)Targetscan生物信息学软件预测UVRAG、STAT3为miR-351-5p作用靶标;(4)UVRAG 受到 miR-351-5p 明显负调控:NC+METH 组较 NC 组 UVRAG表达量显著升高,过表达miR-351-5p后UVRAG表达随之下降,下降明显具有统计学差异;(5)合成的小干扰siUVRAG能够有效沉默细胞中UVRAG的表达:NC+METH组较NC组UVRAG表达量显著上升,转染siUVRAG后能有效降低细胞内UVRAG的表达,差异具有统计学意义;(6)沉默UVRAG对METH诱导的VSMCs自噬有保护作用:NC+METH组较NC组自噬marker基因Beclin-1、LC3-Ⅱ升高显著,有效沉默UVRAG后,Beclin-1、LC3-Ⅱ下降明显具有统计学差异;(7)STAT3 受到 miRA-351-5p 明显负调控:NC+METH 组较 NC 组 STAT3表达量显著升高,过表达miR-351-5p后STAT3随之下降,下降明显具有统计学差异;Tyr-STA3、Ser-STAT3、LCN2的表达变化与STAT3趋势一致;(8)Stattic能够有效抑制细胞中Tyr-STAT3的表达:METH组较control组Tyr-STAT3表达显著升高,1um Stattic作用于细胞Ttyr-STAT3表达未出现较大变化,3-10um作用于细胞起到有效抑制作用,Tyr-STAT3表达显著下降,下降具有统计学差异;(9)抑制Tyr-STAT3对METH诱导的VSMCs自噬有保护作用:NC+METH组较NC组自噬marker基因Beclin-1、LC3-Ⅱ表达量升高显著,有效抑制Tyr-STAT3后,LCN2,Beclin-1、LC3-Ⅱ下降明显具有统计学差异;(10)沉默LCN2对METH诱导的VSMCs自噬有保护作用:NC+METH组较NC组自噬marker基因Beclin-1、LC3-Ⅱ升高显著,有效沉默LCN2后,Beclin-1、LC3-Ⅱ下降明显具有统计学差异;(11)主动脉/夹层血管组织中miR-351-5p靶标的表达:BAPN-METH+组UARAG、STAT3 表达有一定程度升高,BAPN+METH+组 UVRAG、STAT3 表达显著升高;(12)主动脉瘤/夹层血管组织中自噬的表达:BAPN-METH+组自噬marker Beclin-1、LC3-Ⅱ表达有一定程度升高,BAPN+METH+组表达显著升高。第三部分miR-20b-5p在METH诱导的主动脉瘤/夹层中的作用及机制初探(1)合成的miR-20b-5p mimics能够有效得在细胞中过表达:1.0mmol/L METH处理VSMCs 24h后,NC+METH组较NC组下降明显,过表达miR-20b-5p后较NC组迅速上升,升高显著具有统计学差异;(2)过表达miR-20b-5p对METH诱导的VSMCs凋亡有保护作用:NC+METH 组较 NC 组凋亡现象明显,marker 基因 Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3 显著上高,过表达 miR-20b-5p 后,Cleaved-PARP、Cleaved-Caspse3 随之下降,下降明显具有统计学差异;(3)Targetscan生物信息学软件预测PTEN为miR-20b-5p作用靶标;(4)PTEN 受到 miR-20b-5p 明显负调控:NC+METH 组较 NC 组 PTEN表达显著升高,过表达miR-20b-5p后PTEN表达随之下降,下降明显具有统计学差异;CHOP作为PTEN的下游分子,其表达变化与PTEN趋势一致;(5)合成的小干扰siPTEN能够有效沉默细胞中PTEN的表达:NC+METH组较NC组PTEN升高显著,转染siPTEN后,细胞内PTEN表达随之下降,下降明显具有统计学意义;(6)沉默PTEN对METH诱导的VSMCs凋亡有保护作用:NC+METH组较 NC 组凋亡 marker 基因 Cleaved-PARP、Cleaved-Caspse3 升高显著,沉默 PTEN后,Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP表达随之下降,下降明显具有统计学差异;(7)METH诱导的主动脉瘤/夹层血管组织中miR-20b-5p靶标的表达:BAPN-METH+组PTEN表达有一定程度升高,BAPN+METH+组PTEN表达显著升高;(8)METH诱导的主动脉瘤/夹层血管组织中自噬的表达:BAPN-METH+组凋亡 marker Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3 表达有一定程度升高,BAPN+METH+组表达显著升高。