论文部分内容阅读
【目的】氟中毒是一个严重的公共卫生问题,尤其表现在氟骨症。本试验通过探究氟对小鼠MC3T3-E1细胞毒性的作用机制及钙缓解小鼠MC3T3-E1氟毒性的效果,为有效防治和靶向治疗氟中毒提供理论依据。【方法】1.应用CCK-8法筛选出氟和钙的浓度后,将小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞分为对照组（C,MEM培养液）、氟组（F,MEM培养液中添加1.5 mmol/L Na F）和氟加钙组（F+Ca,MEM培养液中添加1.5 mmol/L Na F和0.5 mmol/L Ca Cl2）进行高通量转录组测序。2.通过CCK-8法确定IRE1抑制剂STF-083010的作用浓度和时间后,将MC3T3-E1细胞分为对照组（C,MEM培养液）、抑制组（Y,MEM培养液中添加10μmol/L STF-083010）、补钙组（Ca,MEM培养液中添加0.5 mmol/L Ca Cl2）、钙加抑制组（Ca+Y,MEM培养液中添加0.5 mmol/L Ca Cl2和10μmol/L STF-083010）、氟组（F,MEM培养液中添加1.5 mmol/L Na F）、氟加抑制组（F+Y,MEM培养液中添加1.5 mmol/L Na F和10μmol/L STF-083010）、氟加钙组（F+Ca,MEM培养液中添加1.5 mmol/L Na F和0.5 mmol/L Ca Cl2）和氟加钙加抑制组（F+Ca+Y,MEM培养液中添加1.5 mmol/L Na F、0.5 mmol/L Ca Cl2和10μmol/L STF-083010）八组并检测MC3T3-E1细胞的活力变化,用Hoechst 33342观察凋亡细胞形态,用Fluo 3-AM检测细胞内钙离子含量,用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光检测MC3T3-E1细胞内质网应激及凋亡相关基因和蛋白的表达。【结果】1.随着氟浓度的增加,成骨细胞的活力逐渐降低。当细胞暴露于1.5、2、2.5和3 mmol/L Na F时,细胞活力降低极显著。0.5 mmol/L CaCl2能缓解1.5 mmol/L Na F导致的成骨细胞活力降低。2.与C组相比,F组成骨细胞共鉴定出4027个差异表达基因,显著富集在957个GO条目和82条KEGG通路中。与F组相比,F+Ca组成骨细胞鉴定出9个差异表达基因,显著富集在61个GO条目和20条KEGG通路中。C组和F组的541个差异表达基因被显著富集到38个与内质网和凋亡相关的GO条目中。3.10μmol/L STF-083010处理成骨细胞24 h不会对细胞活力产生影响,Ca组增强了成骨细胞的活力,Ca+Y组和F组降低了成骨细胞的活力。Ca+Y组与Ca组相比,成骨细胞活力降低极显著。与F组相比,F+Y组和F+Ca组增强了成骨细胞的活力。F+Ca+Y组与F+Ca组相比,成骨细胞活力极显著降低。4.Hoechst 33342染色结果显示,氟化物刺激成骨细胞出现收缩、质膜起泡、染色质浓缩和核碎裂等凋亡细胞的特征,加入抑制剂和钙后,细胞核形态有所改善。Fluo 3-AM检测结果显示,与C组相比,F组增加了成骨细胞内钙离子含量;与F组相比,F+Ca组和F+Ca+Y组均降低了成骨细胞内钙离子含量。免疫荧光结果显示,Bi P蛋白在F组中荧光强度最强,主要在细胞质;与F组相比,F+Y、F+Ca和F+Ca+Y组荧光强度明显减弱。5.相比于C组,Y组BiP和IRE1基因表达量降低;Ca+Y组Bax基因表达量升高;F组BiP、IRE1、TRAF2、ASK1、JNK、Bax和Caspase3基因表达量升高,Bcl-2基因表达量下降。和Y组相比,Ca+Y组ASK1和Bax基因表达量极显著上调。Ca+Y组与Ca组相比,Bax基因表达量上调极显著。与F组相比,F+Y组的IRE1和JNK基因表达量降低;F+Ca组Bi P、IRE1、JNK和Caspase3基因表达量降低;F+Ca+Y组Bi P、IRE1和JNK基因表达量降低。F+Ca+Y组与F+Y组相比,Bi P基因表达量降低。F+Ca+Y组与F+Ca组相比,ASK1基因表达量升高。6.F组与C组比较,BiP、IRE1和Caspase3蛋白的表达量升高,Bcl-2蛋白的表达量降低。与F组相比,F+Y组Bcl-2蛋白的表达量显著升高,Caspase3蛋白的表达量极显著降低;F+Ca组IRE1和Caspase3蛋白的表达量显著降低;F+Ca+Y组Caspase3蛋白的表达量极显著降低。【结论】1.5 mmol/L的氟通过激活IRE1信号通路导致小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞凋亡,补充0.5 mmol/L的钙能有效缓解氟对成骨细胞的毒性作用。