研究背景和目的：炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一组病因和发病机制不明确、以慢性炎症为特征的肠道炎性疾病。目前认为可能与基因易感性宿主对肠道微生物及其代谢产物产生异常的免疫应答有关，并且免疫异常在IBD肠道炎症的发生发展中起重要的作用。近年来有关治疗IBD的新制剂多从调节免疫和炎症反应入手，因此，阐明IBD发病过程的炎症反应及其调控机制，对于寻找IBD治疗新靶点、开辟IBD治疗新途径是极为重要的。迄今为止，传统药物治疗包括抗生素类、5-氨基水杨酸类、肾上腺糖皮质激素以及免疫抑制剂，但疗效不理想、副作用大、患者依从性差；新型药物主要为生物制剂如肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）的单抗，但价格昂贵、长期使用的安全性问题尚存争议。因此，我们设想是否可寻找一种内源性的抗炎、促消退调节介质，从而为IBD的治疗提供新的思路？脂氧素(Lipoxins，LXs)是花生四烯酸的重要代谢产物，它在各种炎症相关性疾病组织中广泛表达，能够调节多种炎症相关基因的表达和多种炎性细胞的功能，对炎症反应的及时消退具有重要的作用，被誉为是中性粒细胞介导的组织损伤的“停止信号”或“刹车信号”，在维持机体内环境稳态中起重要的作用。TLRs/NF-κB信号通路与固有免疫及获得性免疫密切相关，既参与机体防御病原体的入侵，又是炎症反应的启动闸门，大量研究表明TLRs/NF-κB信号通路的异常激活在IBD发病中起重要作用。目前，在许多动物及细胞模型中发现LXs能够抑制NF-κB的活化，从而减轻炎症反应，但在IBD中其具体机制又是如何呢，目前尚不清楚，为此，我们进行了本项目的研究。本文旨在体外观察脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对LPS作用的鼠源性巨噬细胞株RAW264.7，明确脂氧素对巨噬细胞中TLR4/NF-κB信号通路的影响及其可能机制，以期为IBD的药物治疗开辟新的思路。研究方法：㈠LPS对巨噬细胞内TLR4/NF-κB信号通路的影响取对数生长期的小鼠巨噬细胞株RAW264.7，用不同浓度的LPS分别作用2h、4h、6h后提取细胞蛋白(重复3次)，免疫印迹方法检测TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白的表达，以确定LPS作用的最佳浓度和时间点。实验分为以下五组：①对照组：不加任何药物处理巨噬细胞；②实验组1：用10ng/ml LPS处理巨噬细胞；③实验组2：用100ng/ml LPS处理巨噬细胞；④实验组3：用1000ng/ml LPS处理巨噬细胞；⑤实验组4：用10000ng/ml LPS处理巨噬细胞；㈡脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对LPS作用巨噬细胞存活的影响实验分组：①对照组：不加任何药物处理巨噬细胞；②脂氧素（LXA4）组：用300nM LXA4处理巨噬细胞；③脂氧素受体激动剂（BML-111）组：用10μM BML-111处理巨噬细胞；④脂氧素受体拮抗剂（BOC-2）组：用10μM BOC-2处理巨噬细胞；以上四组再分为LPS作用与无LPS作用两组，CCK-8检测LPS的细胞毒性及脂氧素的作用。㈢脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞内TLR4/NF-κB信号通路、SOCS2及炎症细胞因子分泌的影响⑴实验分组：①对照组：不加任何药物处理巨噬细胞；②脂氧素（LXA4）组：用300nM LXA4处理巨噬细胞；③脂氧素受体激动剂（BML-111）组：用10μM BML-111处理巨噬细胞；④脂氧素受体拮抗剂（BOC-2）组：用10μM BOC-2处理巨噬细胞；上述四组再分为LPS作用与无LPS作用两组，根据第一部分结果取LPS作用的最佳浓度和时间点(1000ng/ml作用6h),6h后提取细胞蛋白并收集细胞培养上清(重复3次)。⑵检测方法：①实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测巨噬细胞内TLR4、TRAF6、SOCS2mRNA的表达。②蛋白印迹法(Western blot)检测细胞内TLR4、TRAF6、SOCS2及pNF-κBp65蛋白的表达。③酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清中细胞因子IL-6、IL-10的含量。研究结果：㈠LPS对巨噬细胞中TLR4/NF-κB信号通路的影响：①不同浓度LPS作用巨噬细胞2h，各组TLR4蛋白表达均低于对照组(P<0.05)，而1000ng/ml LPS组pNF-κB p65蛋白的表达高于其余各组(P<0.05)；作用4h，在0-1000ng/ml浓度范围内，1000ng/ml LPS组TLR4、pNF-κB p65蛋白的表达显著高于其它浓度组(P<0.05)；作用6h，在一定浓度范围内，巨噬细胞内TLR4及pNF-κB p65蛋白表达随着LPS浓度增加而增加，其中1000ng/ml LPS组显著高于其余各组(P<0.05)。②相同浓度LPS作用巨噬细胞不同时间，100ng/ml LPS作用6h后TLR4和pNF-κB p65蛋白表达均高于2h、4h组，差异有统计学意义（P<0.001, P<0.05）；1000ng/ml LPS组作用4h、6h TLR4蛋白表达显著高于2h(P<0.01)，同时6h显著高于4h(P<0.05)。㈡脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对LPS作用巨噬细胞存活的影响在无LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞的存活率无影响(P>0.05)；而在LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂组细胞存活率显著高于对照组及拮抗剂组(P<0.05,P<0.01)。而同时在对照组及拮抗剂组，LPS作用后巨噬细胞的存活率显著低于相应的无LPS组(P<0.01,P<0.05)。㈢脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞内SOCS2的影响无论有无LPS作用，脂氧素及其受体激动剂组巨噬细胞内SOCS2mRNA及蛋白的表达显著高于对照组和拮抗剂组(P<0.05)，而对照组和拮抗剂组无差别（P>0.05）；各LPS组巨噬细胞内SOCS2mRNA及蛋白的表达与其相对应无LPS组无差别(P>0.05)。㈣脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞中TLR4/NF-κB信号通路和炎症细胞因子分泌的影响①各组细胞中TLR4mRNA及蛋白的表达：无论有无LPS作用，巨噬细胞的TLR4mRNA及蛋白表达在各组之间无差异(P>0.05)；而在LPS作用下，巨噬细胞的TLR4mRNA及蛋白表达显著高于相对应的无LPS组(P<0.05)。②各组细胞中TRAF6mRNA及蛋白的表达：无论有无LPS作用，各组巨噬细胞内的TRAF6mRNA的表达无差异(P>0.05)；各LPS组巨噬细胞内的TRAF6mRNA的表达高于相对应的无LPS组，但仅在对照组有差别(P<0.05)；在无LPS作用下，各组巨噬细胞内的TRAF6蛋白的表达无差异(P>0.05)；在LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂组TRAF6蛋白的表达低于对照组及拮抗剂组(P<0.05)；在LPS作用后TRAF6蛋白的表达在对照组及拮抗剂组高于相对应的无LPS组(P<0.05)；而在脂氧素及其受体激动剂组，无论有无LPS作用TRAF6蛋白的表达无差异(P>0.05)。③各组细胞pNF-κB p65蛋白的表达：在无LPS作用下，各组巨噬细胞内的pNF-κB p65蛋白的表达无差异(P>0.05)；在LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂组pNF-κB p65蛋白的表达低于对照组及拮抗剂组(P<0.05)；在LPS作用下，拮抗剂组pNF-κB p65蛋白的表达高于其余各组(P<0.05)，同时在对照组及拮抗剂组高于相对应的无LPS组(P<0.05)；而在脂氧素及激动剂组，无论有无LPS作用pNF-κB p65蛋白的表达无差异(P>0.05)。④各组细胞培养上清中IL-6、IL-10的含量变化a在无LPS作用下，各组巨噬细胞培养上清中IL-6的含量无差异(P>0.05)；在LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂组IL-6的含量低于对照组及拮抗剂组(P<0.05)；无论有无脂氧素处理，LPS作用组IL-6的含量显著高于相应的无LPS组(P<0.05)。b在无LPS作用下，各组巨噬细胞培养上清中IL-10的含量无差异(P>0.05)；在LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂组IL-10的含量低于对照组(P<0.05)；在对照组中无论有无LPS作用，巨噬细胞培养上清中IL-10的含量无差异(P>0.05)；而在脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂组中，LPS作用后巨噬细胞培养上清中IL-10的含量显著高于相应的无LPS组(P<0.05，P<0.01)。结论：1、LPS能够激活鼠源性巨噬细胞TLR4/NF-κB信号通路，并在一定范围内呈浓度依赖性。2、脂氧素能够逆转LPS对巨噬细胞的毒性作用。3、脂氧素能够通过上调小鼠巨噬细胞TLR4/NF-κB信号通路的负性调控因子SOCS2的表达，促进TRAF6的降解，抑制NF-κB的核转位及促炎细胞因子的分泌，促进抗炎细胞因子的分泌，从而减轻炎症反应。