家蚕是重要的经济昆虫，在我国，蚕丝业已有5000 多年的悠久历史，从古至今在经济文化生活中占有重要地位。家蚕作为鳞翅目昆虫的模式，具备了大量的遗传、生理、和分子生物学积累，2004年家蚕基因组框架图的完成，为家蚕功能基因组学研究奠定了基础。 根据果蝇等模式生物的研究结果，作为卵生生物的家蚕，其早期胚胎发育的启动和形态建立等生命活动，是在母性效应基因（maternal gene）的作用下进行的。发掘并研究家蚕的胚胎发育、性别决定、性细胞发育等重要生命过程相关的关键功能基因，对于了解家蚕这一模式生物的早期胚胎发育的调控的分子机理具有重要的实际意义，同时，对于其他鳞翅目昆虫的研究具有指导意义。 本研究根据家蚕表达序列标签（EST）数据库，结合利用生物信息学技术和cDNA 末端快速扩增（RACE）技术，从家蚕p50 品种的未受精卵克隆获得了家蚕若干个新基因的cDNA序列，对所获得的序列进行开放阅读框、外显子和内含子分析，预测了蛋白的理化性质、保守结构域并进行了分子进化分析。 主要研究结论如下： 一、家蚕Bmtimeless 2基因的克隆与分析 1. 克隆获得了家蚕Bmtimeless 2(Bmtim 2)基因部分cDNA序列(GenBank 登录号：EU589584)。家蚕tim 2基因cDNA序列长度为1867 bp，推定位于1748bp处的TAG为终止密码子，该序列具有完整的3’末端，3’UTR 长度为112bp。 2. 对以该终止密码子相位推导获得的蛋白序列进行进化分析，表明与果蝇、蜜蜂等生物钟基因tim-2 编码蛋白有较高的同源性，与家蚕生物钟蛋白BmTIM 比较，两者之间的氨基酸序列同源性只有8.30％。同源氨基酸序列进行比对分析表明，210-576 氨基酸残基之间为保守结构区，为Timeless蛋白C末端保守区。 3. 利用实时定量RT-PCR技术分析了家蚕Bmtim 2基因在不同发育时期的的表达水平。该基因在所测试的从未受精卵到蛹期的家蚕生活周期各时点均有表达，1-3 龄起蚕的表达量逐渐增加，4 龄起蚕下降，在5 龄起蚕达到最高峰。化蛹初期急剧下降至未受精卵水平，其后又随蛹期发育逐渐上升。 二、家蚕中一个未知基因全长cDNA的克隆与分析 1. 克隆获得了家蚕未知基因（Bm-novel）全长cDNA序列。Bm-novel基因cDNA(GenBank 登录中)长度为2039bp，其中包括406 bp的5’端非编码区（5’UTR）、1459bp的蛋白质编码区、终止密码子TAA和272 bp的3’端非编码区（3’UTR）、25bp的polyA 尾。ORF 从cDNA的407 位起始，在1867 位终止，长度为1461bp，编码486个氨基酸。 2. 对家蚕Bm-novel基因cDNA 进行Blastx 分析表明，发现它与草履虫（Paramecium tetraurelia strain d4-2）的hypothetical protein GSPATT00021182001（XP_001454936.1）、阴道滴虫（Trichomonas vaginalis G3）viral A-type inclusionprotein（putative）相同氨基酸比例为22％左右。 3.生物信息学分析表明，该基因编码酶类蛋白的可能性达到67.8％。由于该蛋白不含信号肽，推测编码的是胞内酶。 4. RT-PCR 分析表明，Bm-novel基因在卵期、幼虫期、蛹期均有表达，但在胚胎发育阶段Bm-novel的表达明显高于胚后发育阶段。可以认为，Bm-novel基因在细胞分裂、分化或发育上起到重要作用。 三、家蚕未受精卵中若干基因cDNA的克隆 1. 以家蚕未受精卵EST序列（CA945995）为基础，通过5’和3’RACE技术，克隆获得了长度为1117 bp的新cDNA序列BMG03，网上比对未能发现高分值的同源蛋白序列。 2. 以家蚕未受精卵EST序列（CA946247）为基础，通过5’和3’RACE技术，克隆获得了长度为766bp的新cDNA序列BMG23，网上比对未能发现高分值的同源蛋白序列。 3. RT-PCR 分析发现这两个基因在家蚕中各时期均有所表达，且其表达强度变化与BmA3基因的表达强度变化趋势一致，表明这2个cDNA 所代表的基因编码的蛋白可能都是与细胞基本生命过程相关。