研究背景和目的组织因子(Tissue factor, TF)是一个由263个氨级酸组成的跨膜糖蛋白,其基因位于染色体1P21-1p22,总长度12.4kb,含6个外显子和5个内含子,所转录的mRNA为2.1kb,最终翻译修饰成的TF位于细胞表面的一单链跨膜糖蛋白(相对分子量为47kd),属于二级细胞因子受体家族。TF分为含有可溶性的氨基末端的胞外区(丝氨睃1～谷氨酸219)、跨膜区(异亮氨酸220～亮氨酸242)和羧基末端的胞内区(组氨酸243～丝氨酸263),其胞外区的凝血因子Ⅶ/Ⅶa (Coagulation factorⅦ/Ⅶa, FⅦ/Ⅶa)受体可与血浆中FⅦ结合,激活FⅦ形成TF-FⅦa复合物,在始动机体外源性的凝血过程中起到了关键的作用。根据TF是否与细胞膜结合分为膜结合性TF和可溶性TF,后者又根据是否与血液中的微粒结合分为具有促凝活性的微粒结合型TF (TF-Microparticles,TF-MPs)和非微粒结合型TF。最近也有学者发现单核细胞表达产生全长型TF (full length tissue factor, flTF)和选择剪切型TF (alternatively spliced tissue factor, asTF),后者因缺少正常TF基因的外显子5编码的跨膜区故为可溶性TF,其凝血活性较前者弱,但在新生血管的形成和肿瘤侵袭中可能起到了重要作用。在生理情况下,循环血液中TF的量极低,正常细胞包括血管内皮细胞和血液中的单核细胞都不表达TF,除非受到外界刺激如损伤、炎症等。但是许多研究却发现在肿瘤患者的血液中可以检测到异常高表达的TF-MPs,认为这垦是从肿瘤细胞表面脱落释放入血;并发现肿瘤患者无论其肿瘤还是周围组织细胞中TF都是高表达。TF的高表达不仅增加了肿瘤患者血栓事件的发生,而且参与了肿瘤的恶性进展。在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和神经胶质瘤的研究证据中都表明肿瘤组织TF的表达量与相关肿瘤的临床病理特征和生存期呈负相关,TF可以通过凝血和非凝血两途径来促进肿瘤的生长和转移。其信号转导通路没有完全明确,但是目前认为主要是蛋白酶活化受体(protease-activated receptors, PARs)家族介导信号的转导(PARs属于G蛋白偶联受体,分为PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4四亚型)。凝血途径：(1)TF与FⅦ形成活化的TF-FⅦa复合物激活肿瘤细胞表面PAR-2,之后的TF-FⅦa-FXa复合物可以激活PAR-1和PAR-2,再通过ERK1/2 (p44/42) MAPK、p38 MAPK及JNK信号转导上调血管内皮生长因子(endothelial growth factor, VEGF)表达和抑制抗血管生成蛋白如凝血栓蛋白(thrombospondin-1, TSP-1)的表达；其次FⅦ可使细胞内Ca2+浓度升高激活蛋白激酶(protein kinase C, PKC),使胞内肌动蛋白结合蛋白-280(actin-binding protein 280, ABP-280)与TF胞浆尾区结合,上调MAPK信号活化局部粘附激酶(focal adhesion kinases, FAK)(?)曾加肿瘤细胞的粘附性和迁移性；(2)TF启动外源性凝血途径产生凝血酶(thrombin),后者与PAR1、PAR3和PAR4结合通过MARK通路产生各种促肿瘤生长因子如VEGF、VEGFR、bFGF和MMP-2等。非凝血途径：TF受体胞内尾区的3个丝氨酸残基容易被胞内的PKC磷酸化,产生的信号上调各种促肿瘤生长因子表达。全世界每年大约有一百六十万新增肺癌患者,同时接近有一百四十万肺癌患者死亡,肺癌已是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌(Non small cell lung cancer, NSCLC)主要包括腺癌和鳞癌,约占肺癌总数的85%左右,NSCLC的治疗在过去十几年中取得了巨大的进步,由单一的手术和放化疗手段发展到目前的个体化治疗策略,特别是针对肺癌生物学机制的分子靶向治疗,如作用EGFR途径的药物取得了巨大的成绩,因此寻找肺癌分子作用靶点是目前研究治疗的重点。关于TF在NSCLC中过表达的研究较少,并且沉默TF的表达能否抑制肺腺癌的增殖和转移,促进腺癌的凋亡,以及机制相关的研究尚无文献报道。因此通过研究TF在肺腺癌中的作用以期有助于发现治疗肺癌新的分子作用靶点。在本研究中,我们首先收集73例非小细胞肺癌和14例肺良性病变患者的标本,采用western blot和免疫组织化学的方法检测TF的表达,发现TF在NSCLC(?)中的表达高于肺良性病变组织,肺腺癌组织高于鳞癌组织。因此,在体外研究中,应用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术抑制TF在肺腺癌细胞系A549中的表达,研究TF对肺,腺癌细胞恶性生物学行为的影响及其可能的分子机制；进一步在体内研究中,采用裸鼠A549细胞移植瘤的模型来验证抑制TF的表达对肺腺癌的作用。从而在细胞水平和动物整体水平来明确特异性沉默TF能否抑制肺腺癌细胞的恶性行为,为未来针对TF治疗肺癌的可行性提供理论的基础。一、标本研究组织因子在非小细胞肺癌中的表达及其意义实验目的：研究组织因子在非小细胞肺癌中的表达,探讨其与非小细胞肺癌的临床病理特征的关系。实验方法：1.收集同济医院胸外科2009年1月～2011年3月73例非小细胞肺癌的癌组织和癌旁组织(距离癌组织边缘2 cm)的手术标本和14例肺良性病变患者的标本作为对照,每例标本取材后分两份,1份置于液氮速冻后-80℃超低温冰箱保存,1份置于4%的中性甲醛固定后石蜡包埋,做HE染色和免疫组化染色;2.采用(?) western blot检测73例非小细胞肺癌组织、癌旁组织标本以及14例肺良性病变标本TF的表达；3.免疫组织化学的放法检测73例非小细胞肺癌组织、癌旁组织标本以及14例肺良性病变标本TF的表达。实验结果：1. Western blot检测结果显示TF非小细胞肺癌中的表达高于肺良性病变组织(P＜0.01),癌组织高于癌旁正常组织(P＜0.05或P＜0.01),肺腺癌高于鳞癌(P＜0.01),肺腺癌分化程度越低表达越高(P＜0.01);2.免疫组化染色的检测可以发现非小细胞肺癌组织染色阳性率100%(n=73)明显高于对照良性钟楼组阳性率35.7%(n=5)(P＜0.01)。肺腺癌组织标本中高表达率63.2%(n=24)明显高于肺鳞癌组织标本高表达率37.1%(11=13)(P＜0.05),低分化非小细胞肺癌中TF的高表达率高于高中分化(P＜0.05),晚期(Ⅲ希Ⅳ期)非小细胞肺癌中的表达高于早期(Ⅰ和Ⅱ期)(P＜0.05)二、体外实验抑制组织因子的表达对肺腺癌影响的体外研究实验目的：探讨抑制TF表达对肺腺癌恶性生物行为的影响及其可能的分子机制。实验方法：1.肺腺癌细胞系A549用含10% FBS, 100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI 1640培养基培养,并置于含5%CO2、37℃的潮湿培养箱中培养。细胞在对数生长期时用于实验；2.化学合成特异性沉默TF的siRNA (TF-siRNA),使用脂质体转染试剂lipofectamine 2000转染A549细胞,siRNA转染浓度分别为25nM,50nM和100 nM,转染后24h、48h、72h和96h收获细胞进一步检测。阴性对照组(Mock组)转染随机对照siRNA (NC-siRNA),空白对照组为不处理组；3.带荧光的siRNA转染A549细胞后用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,采用western blot和逆转录半定量PCR检测TF-siRNA对A549的TF的沉默效果；4.用MTT检测TF-siRNA转染后24h、48h、72h和96h对A549细胞增殖的影响;5. TF-siRNA转染A549细胞48h后,做克隆形成实验来观察抑制TF表达对A549克隆形成能力的影响；6. TF-siRNA转染A549细胞48h后,行划痕实验观察抑制TF表达对肺腺癌迁移能力的影响;7. TF-siRNA转染A549细胞48h后,使用transwell小室检测抑制TF的表达对肺腺癌侵袭和迁移能力的影响；8. TF-siRNA转染A549细胞48h后,采用AnnexinV-FITC和PI染色的凋亡试剂盒在流式细胞仪上检测抑制TF表达对肺腺癌的影响；9. TF-siRNA转染A549细胞48h后,收集细胞提取细胞总蛋白,应用western blot方法检测细胞PI3K、P-AKT、总AKT、P-ERK,总ERK、VEGF、MMP-2、MMP-9和β-actin的表达。实验结果：1. TF-siRNA可以有效的转染A549细胞,使用浓度为1 00nM带FAM荧光的siRNA转染细胞后48h在荧光显微镜下观察和转染后6h流式细胞仪检测发现转染效率都可达85%以上；2. TF-siRNA转染A549细胞48h后,western blot和逆转录半定量PCR检测发现TF在蛋白和mRNA水平表达明显下降,与Mock组(对照组)比较有统计学差异,并随25nM (P<0.05)、50nM (P<0.01)和100nM (P<0.01)浓度的增高抑制增强,有剂量依赖性；3. TF-siRNA转染A549细胞48h后,行克隆形成实验后发现50nM和100nM TF-siRNA浓度组形成的克隆数分别为(205.0±13.2)和(132.3±11.7)个,与Mock组(490±19.1)比明显较少,有统计学意义(P<0.01)；4. TF-siRNA转染A549细胞48h后,划痕实验检测细胞迁移能力显示50nM和100nM TF-siRNA浓度组的迁移指数分别为(0.35±0.06)和(0.23±0.09),与Mock组(0.61±0.05)比明显减小,有统计学意义(P＜0.01);用transwell小室检测迁移的细胞数显示50nM和100nM TF-siRNA浓度组每个视野分别(111.0±10.6)和(75.7±11.0)个,与Mock组(202.7±7.1)比明显减少,有统计学意义(P＜0.01)；5. TF-siRNA转染A549细胞48h后,用铺有订Matrigel胶的transwell小室检测细胞侵袭能力显示50nM和100nM TF-siRNA浓度组每个视野细胞数分别(76.7±7.6)和(40.0±5.0)个,与Mock组(155.3±8.6)比明显减少,有统计学意义(P＜0.01)；6. TF-siRNA转染A549细胞48h后,流市细胞仪上检测细胞凋亡发现25nM、50nM和100nM TF-siRNA浓度组凋亡率分别为(7.62±1.20)%、(10.51±1.36)%和(17.36±1.59)%,其中50nM和100nM浓度组与Mock组(5.77±0.96)%相比明显增高(P<0.05),并有浓度依赖性;7. Western blot检测结果提示TF-siRNA转染A549细胞48h抑制TF表达后引起了PI3K/AKT、ERK MAPK信号通路的抑制以及VEGF和MMP-2/-9表达的成少,与Mock组比较有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)。三、体内实验抑制组织因子的表达对肺腺癌影响的体内研究实验目的：探讨在裸鼠的肺腺癌移植瘤模型中抑制TF的表达对肺腺癌生长的影响。实验方法：1.肺腺癌细胞系A549用含10% FBS、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI 1640培养基培养,并置于含5% CO2、37℃的潮湿培养箱中培养。调整细胞状态,使细胞处于最佳用于实验；2.实验用15只雌性BALB/c nu/nu裸鼠适应饲养环境7天后,随机分为3组,每组5只,每只于右侧背部皮下种植约1×107个肺腺癌A549细胞,观察14天后右背部肿瘤都可长至50-100 mm3大小,然后根据分组进行实验,3组分别为：(1)空白组,不处理；(2) Mock组即对照组,每5天瘤内注射50ug阴性对照siRNA,共6次；(3)SiTF组,每5天瘤内注射50ugTF-siRNA,共6次。每周2次利用游标卡尺测量肿瘤的长短径,根据以下公式计算肿瘤的体积：体积(V,mm3)=长径(L,mm)×[短径(W, mm)]2/2。实验动物所有的操作程序均符合同济医院动物实验中心的实验动物管理与使用指南和中国科学院实验动物管理规范标准；3.实验完成后处死裸鼠,剥离出右背部皮下肿瘤,称重并拍照。每个肿瘤分两份,一份由液氮速冻后放入-80℃超低温冰箱保存备用,另一部分组织标本放入4%中性甲醛溶液行固定后脱水石蜡包埋再置于室温保存备用；4.应用Western blot和免疫组化方法检测肿瘤组织中TF的表达。实验结果：1.裸鼠种植A549细胞14天后,空白组、Mock组和SiTF组右背部肿瘤大小分别为(95.15±22.97) mm3、(95.42±39.31) mm3和(88.52±28.38)mm3,比较没有统计学意义(P＞0.05),当天开始用siRNA干预；之后种植后18天、22天、26天、30天、34天、38天和42天3组肿瘤大小分别为空白组：(136.22±27.46) mm3、(229.28±45.34) mm3、(351.74±76.38) mm3、(428.81±91.96) mm3、(517.98±106.04) mm3、(562.73±173.30) mm3和(601.02±84.72) mm3; Mock组(147.05±37.97) mm3 (242.43±60.49) mm3、(319.04±75.26) mm3、(389.31±93.84) mm3、(471.26±117.57) mm3、(502.56±22.64) mm3和(513.81±112.57) mm3; SiTF组(103.22±30.42) mm3、(108.77±32.68) mm3、(121.32±42.83) mm3、(140.69±53.33) mm3、(156.16±57.32) mm3、(176.07±66.79) mm3和(209.56±97.56) mm3。从种植后22天即TF-siRNA干预后8天起实验TF-siRNA组肿瘤生长明显较Mock组和空白组减慢,有统计学意义(P＜0.01)：2.种植瘤42天后处死动物,分离皮下的肿瘤称重三组分别为空白组(0.59±0.18) g、Mock组(0.524±0.12)g和SiTF组(0.21±0.10) g, SiTF组与Mock组比较明显减轻,比较有统计学意义(P＜0.01)；3.裸鼠肺瘤行western blot检测发现SiTF组TF的表达明显下降,与Mock组比较有统计学意义(P<0.01)。统计学分析采用统计学软件SPSS12.0进行数据分析。计数数据用频数(构成比)进行统计描述,采用x2(卡方)检验比较两组差别。计量数据用均数±标准差(x±SD)进行统计学描述,采用均数t检验和方差分析(ANOVA)比较两组组内、组间的差别。所有统计检验都为双侧检验,P＜0.05为差异有统计学意义。结论1.TF不仅在NSCLC中过表达,且与NSCLC的临床病理特征有关,其中肺腺癌中TF的表达量和高表达率高于肺鳞癌,低分化高于高中分化,晚期(Ⅲ和Ⅳ)高于早期(Ⅰ和Ⅱ期)。2.体外一直肺腺癌细胞TF的表达可以一直癌细胞的增殖和克隆新城能力,促进癌细胞的凋亡。3.体外抑制肺腺癌细胞TF的表达可以抑制癌细胞浅议和侵袭能力。4.体外抑制肺腺癌细胞TF的表达引起了VEGF和MMP-2/-9表达的下降,同时PI3K/AKT、ERK MAPK信号通路可能参与了TF在肺癌中的作用。5.裸鼠移植瘤体内研究表明抑制肺腺癌TF的表达可以抑制肿瘤的生长。6.本实验为研究TF成为治疗肺癌新分子治疗疗靶点,开发新的治疗药物提供了定的理论依据。