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盐胁迫下,植物生长发育减缓,出现衰老甚至死亡现象。植物体内会产生一系列的生理生化机制来适应环境中的盐胁迫,包括减少对Na+的吸收,积累一些可溶性的渗透调节物质等。通过对植物耐盐分子机制的研究,发现调控植物体内离子平衡的阳离子转运系统在耐盐过程中起到非常重要的作用。质膜上Na+/H+逆转运蛋白SOS1(salt overly sensitive 1)可以将细胞质中过多的Na+排出细胞,降低Na+的毒害作用。海马齿是一种生长在滨海的红树林植物,耐盐能力强让其成为一种比较好的耐盐研究材料。本研究从盐生植物海马齿中克隆了4个与SOS1功能调控相关的基因,利用酵母和拟南芥异源表达系统,研究它们的耐盐功能,旨在了解海马齿的耐盐调控途径,为探索植物的耐盐机理提供理论依据,主要研究结果如下:1利用同源克隆和RACE技术,从海马齿中分离到Na+/H+逆转运蛋白基因SpSOS1。进化树分析表明,SpSOS1蛋白属于离子转运CPA(monovalent cation/proton antiporters)系统中的SOS1亚家族,与拟南芥AtSOS1,水稻OsSOS1,小盐芥ThSOS1的相似度分别达到61.53%,60.58%,和60.39%。荧光定量PCR结果显示根中SpSOS1基因受盐胁迫诱导表达,而茎和叶中SpSOS1基因的表达量受盐胁迫影响较小。亚细胞胞定位表明SpSOS1蛋白定位于质膜上。酵母功能互补实验表明,SpSOS1基因可以互补酵母突变体AXT3K的盐敏感性,对Na+,K+,Li+都具有一定的耐受性。盐胁迫下,SpSOS1蛋白可以互补sos1突变体的盐敏感性,转SpSOS1基因幼苗生长好于突变体拟南芥。2利用RACE技术从海马齿中克隆到质膜H+-ATPase基因SpAHA1,根中SpAHA1基因和SpSOS1基因的表达模式相似,均受盐胁迫诱导,亚细胞定位表明SpAHA1蛋白位于质膜上。共表达SpAHA1基因和SpSOS1基因的转基因酵母耐盐性要明显强于转单个基因的酵母,通过测定转基因酵母中的离子含量,发现转两个基因的酵母中Na+含量显著低于转单个基因的酵母。通过构建人工蛋白脂质体,提纯转基因酵母质膜,发现共转化两个基因酵母的质膜H+-ATPase活性和Na+/H+交换活性明显强于其它类型的酵母。说明质膜H+-ATPase SpAHA1可以为质膜Na+/H+逆转运蛋白SpSOS1运输Na+提供能量。3用PCR的方法克隆一系列SpSOS1基因的3’-末端缺失突变体,利用酵母异源表达系统进行功能分析。确定了SpSOS1蛋白的自抑制区位于986 aa到1060 aa之间,活性必备区位于氨基酸882-986之间。将拟南芥中单个的AtSOS2基因,共表达AtSOS2和AtSOS3基因的复合体AtSOS2/At SOS3(AtCBL4)分别与海马齿SpSOS1及其突变体共同转化酵母突变体AXT3K,功能分析发现SpSOS1蛋白受到单独的AtSOS2或者AtSOS2/AtSOS3复合体的调控,但SpSOS1中受调控位点除了DSPS氨基酸外,还存在其它的调控区域,可能位于氨基酸1005 aa-1045 aa之间。我们同时研究了CBL家族中其它蛋白与SOS2互作后对SpSOS1的调控作用,发现除了SOS3(CBL4)蛋白外,只有CBL10与SOS2互作后可以调控SpSOS1,它们调控SpSOS1的位点位于氨基酸1005 aa-1020 aa之间。4从海马齿中克隆到的SpCIPK8和SpCBL10基因编码的蛋白分别属于CBL-CIPK调控途径中的CIPK家族和CBL家族。生物信息学分析发现SpCIPK8蛋白与拟南芥At CIPK8的亲缘关系最近,相似度达到77.63%;而SpCBL10蛋白与拟南芥AtCBL10的亲缘关系最近,相似度达到68.65%。荧光定量PCR结果表明,根中SpCBL10和SpCIPK8基因均受盐胁迫诱导上调表达。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达方法,研究SpCBL10和SpCIPK8蛋白在细胞中的定位,结果显示SpCBL10蛋白定位于质膜上,而SpCIPK8蛋白定位于细胞质中。酵母双杂交实验表明SpCIPK8和SpCBL10蛋白在体内是可以互作的,互作区域分别位于SpCIPK8的C末端147个氨基酸中以及SpCBL10蛋白C末端的30个氨基酸中。双分子荧光互补实验(BiFC)证实这两个蛋白可以在植物体内互作,且互作位置发生在细胞膜上。5完整的SpCIPK8蛋白不能调控SpSOS1的活性,但只保留激酶区的突变体SpCIPK8-306可以调控SpSOS1,使得转基因酵母耐盐性显著提高,而当位于激酶区的第38个氨基酸赖氨酸(K)突变为天冬酰胺(N)后,SpCIPK8-306K38N失去激酶活性,不能调节SpSOS1蛋白的活性。SpCIPK8-306蛋白激酶调节SpSOS1的作用化位点是其C-末端的DSPS区域,且不存在其它位点。SpCIPK8与SpCBL10互作后可以调控SpSOS1的活性,且SpCIPK8/SpCBL10复合体的活性与突变体SpCIPK8-306的活性相似。它们构成了一个新的耐盐调控途径:钙结合蛋白SpCBL10与蛋白激酶SpCIPK8结合后,作用于SpSOS1的DSPS区域,调控其活性。