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力学微环境会随着肿瘤生长和发展改变并对肿瘤产生影响,胞外基质的力学性质既能影响肿瘤恶性表型,又能促进肿瘤的进程,影响肿瘤的侵袭转移。利用软纤维蛋白胶构建的体外三维培养系统可以高效的筛选出具有自我更新能力的高致瘤性肿瘤再生细胞(Tumor repopulating cells,TRCs)。肿瘤再生细胞已经在抗癌药物的筛选、肿瘤免疫治疗等研究中崭露头角,细胞应力纤维骨架、Sox 2基因表达、组蛋白甲基化水平等因素都对肿瘤再生细胞的形成有重要影响,但力学微环境影响肿瘤再生细胞形成的机制并没有系统的阐明。本课题以人类肿瘤细胞系HeLa细胞为研究对象,对肿瘤再生细胞形成的时序性样本进行转录组测序(RNA-Seq,miRNA-Seq)及全基因组DNA甲基化测序,并构建转录因子、miRNA、靶基因的共调控网络,结合差异表达基因的GO和KEGG通路的富集分析,寻找肿瘤再生细胞形成中关键的转录因子、miRNA及通路,并结合实验验证系统探讨生物力诱导肿瘤再生细胞形成的可能机制。主要研究内容及结果如下:(1)在90 Pa三维软胶中培养的肿瘤再生细胞与普通平板培养的细胞相比,具有更强的侵袭转移能力,并且干性基因如SOX2、NANOG、OCT4的表达量显著增加。(2)通过研究肿瘤再生细胞时序过程中转录组图谱的改变,发现了许多整合素、细胞膜以及干性相关基因的表达量随着力学微环境变化而发生改变,例如MYC、STAT3以及hsa-miR-199a-5p等,它们通过调控细胞膜相关基因及其下游的力传导信号通路(Hippo、WNT、TGF-β以及PI3K-AKT信号通路),继而影响下游的癌症相关基因。(3)通过整合膜蛋白相关基因、WNT通路相关基因和癌症相关基因的交互网络,我们发现了肿瘤再生细胞筛选过程中的几个关键因子:ATF4、SLC3A2、CCT3以及hsa-miR-199a-5p。发现沉默关键转录因子ATF4以及肿瘤相关基因CCT3可以抑制肿瘤再生细胞的筛选及生长,而沉默力传导相关基因SLC3A2却对肿瘤再生细胞的筛选及生长有显著的促进作用,hsa-miR-199a-5p也显著抑制肿瘤再生细胞的筛选及生长。(4)进一步的研究发现CCT3在体外能促进肿瘤细胞的增殖及干性基因的表达,而沉默CCT3可以抑制肿瘤再生细胞的成瘤能力,CCT3可能在肿瘤的发生中作为干性相关基因发挥了重要作用。(5)对肿瘤再生细胞筛选过程中的时序性样本进行的差异性甲基化基因的整体分析发现,肿瘤再生细胞的非CG类型甲基化程度相较于普通肿瘤细胞显著增加,而非CG甲基化多发生在诱导多能干细胞及胚胎干细胞中,在分化的细胞中较低或消失,推测非CG甲基化为肿瘤再生细胞筛选过程中的DNA甲基化特征。我们的研究结果通过转录组学及表观遗传学分析,较全面的探讨了生物力诱导肿瘤再生细胞筛选的机制,这为后续抗癌药物的研究提供了新的靶点。