近年来，哮喘已经成为全球范围内严重威胁公众健康的慢性疾病。虽然目前已经有一些针对哮喘的有效的药物，但仍不能完全控制哮喘的发生。大量病理学的研究证明，哮喘的发生不仅存在着气道炎症，而且还包括气道结构的改变，即气道重塑（airway remodeling）。其病理改变主要表现为平滑肌增厚和基底膜增厚及其玻璃样变，由此可导致气道不可逆性的阻塞和气道高反应性（AHR）。气道重塑现已公认是慢性哮喘的一个特征，尤其表现在那些患有严重的哮喘和肺功能进行性减退的病人。它是致命性和非致命性哮喘的共同特点。其中气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖是导致气道重塑的主要构成因素之一，而平滑肌的收缩及增殖与细胞内的钙离子是密不可分的。多数细胞的胞内肌浆网上存在两种钙释放通道，即Ryanodine受体／钙通道（RyRs）和三磷酸肌醇受体／钙通道（IP₃Rs）。国内外学者己探讨了RyR1-3及IP₃R1-3在血管平滑肌中的表达及其在肺动脉高压、心肌肥厚及血管重塑等病理过程中的意义。但在ASMCs中是否存在RyR、IP₃R以及表达何种亚型，是否参与了哮喘气道重塑的发生过程，目前尚未见报道。为此，本课题选取大鼠的气道平滑肌为研究对象，检测了正常大鼠及慢性哮喘大鼠气道平滑肌中的RyR1-3及IP3R1-3的mRNA水平，观察受体各亚型在哮喘反复发生过程中的变化，并利用反义寡核苷酸技术，探讨了RyRs及IP₃Rs参与哮喘气道重塑的可能机制。 研究内容： 1．根据GenBank中登录的大鼠RyR1-3及IP₃R1-3的相关序列，设计6对引物，另外设计β-actin引物对，作为内参照。利用从气道平滑肌中提取的总RNA为摸板，进行RT-PCR扩增，并将扩增得到的目的片段与克隆载体连接进行DNA序列测定。 2．利用氢氧化铝凝胶作为佐剂，卵蛋白致敏并激发哮喘，每周激发3次，每次40min，共激发10周制备慢性哮喘大鼠模型。每2周取一组大鼠气道平滑肌，利用RT-PCR技术测定RyR1-3及IP₃R1-3的mRNA表达。同时留取各组大鼠右肺中叶制备病理切片并HE染色，用图像分析仪测定大、中、小气道内外径、平滑肌层及黏膜层的厚度，并利用α-肌动蛋白抗体进行免疫组化，测定平滑肌表达的变化。 3．采用胶原酶消化法从原代培养了大鼠ASMCs，免疫细胞化学方法进行了鉴定。第二军医大学博十学位论文 4.根据RyR及IP3R的相关序列设计2对正义链及2对反义链寡核营酸，借助阳离子脂质体将寡核营酸导入AsMCs中，RT一PcR法测定了转染前后各RyRI一3及IP3RI一3的表达，MTS/PEs法测定了转染前后AsMcs的增殖情况。 5.利用流式细胞仪及激光扫描共聚焦显微镜测定了转染反义RyR及IP3R寡核营酸前后及加入咖啡因后细胞内的钙离子浓度的变化。 结果: 1.RT一PCR扩增得到了6个与预期值大小一致的片段，与克隆载体连接后，进行DNA序列测定，表明扩增得到的片段与GenBank中登录的大鼠RyRI一3及IP3RI一3序列一致。 2.大鼠右肺中叶病理切片显示哮喘组大鼠气道管腔变窄，大、中、小气道平滑肌层和勃膜层与正常组比较均明显增厚，尸<0.01。RT一PCR结果显示第6周起受体的表达开始上调，RyRI的表达水平较正常对照组有明显的上调，尸<0.05:IP3RI的表达与对照组比，p<0.01;第10周时RyRI及IP3RI一2的mRNA水平明显高于正常对照组，尸<0.01:而RyRZ的表达也有明显上调，尸<0.05。 3.原代培养的ASMCs经a一actin免疫酶细胞化学染色得到证实。阳离子脂质体介导转染体外合成的反义RyR及IP3R寡核普酸入AsMCs后，RT一PCR结果显示RyRI一3及IP3RZ一3的表达受到明显的抑制。 4.流式细胞仪及激光扫描共聚焦测定结果显示静息状态下未转染的、转染正义寡核普酸的及转染反义RyR、IP3R寡核昔酸的ASMCs中钙离子浓度无明显差别，但当滴加咖啡因刺激时，没有转染及转染正义RyR寡核昔酸的AsMcs，胞内钙离子浓度明显上升;而转染反义RyR寡核普酸的ASMCs胞内的钙离子浓度变化不明显。 5.MTS用Es测定结果显示，转染反义RyR及IP3R寡核昔酸的AsMcs增殖受到明显的抑制，与对照组比，尸<0.01。 结论: 1.气道平滑肌中RyRI一3及IP3RI一3共同表达，提示AsM中存在复杂的钙调节机制。 2.RyRI一2及IP3RI一2可能参与了哮喘气道重塑的发生。 3.RyR及IP3R可能通过影响细胞内的钙离子浓度促进平滑肌细胞的增殖，加速了气道重塑的发生。 该研究为慢性哮喘气道重塑的研究与治疗提供了一定的实验依据。