论文部分内容阅读
研究目的了解2017年10月～2019年6月河南省漯河市住院严重急性呼吸道感染（Severe acute respiratory infection,SARI）病例的病毒性病原谱构成及其在不同年龄组中的分布特征,为SARI病例的临床诊治及其预防控制提供病原学依据。描述我国HMPV相关病例的流行病学特点及其临床特征;探究河南省漯河市流行的HMPV病毒基因特征以及基因变异变迁规律。材料与方法基于我国SARI病例监测方案,于2017年10月～2019年6月期间,采集河南省漯河市中心医院SARI住院病例的咽拭子,收集其流行病学和临床特征信息。采用多重荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real time reverse transcription polymerase chain reaction,Real-Time RT-PCR）对采集的咽拭子标本进行 19 种常见呼吸道病毒的病原学检测,分析病毒阳性病例病原谱构成情况。对筛选出的HMPV阳性病例进行流行病学分析,并采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）进行 HMPV G 基因及代表株全基因组序列扩增,使用Sanger一代测序的方法获得基因序列。结合全球G基因或全基因组代表株,采用MEGA7.0进行基因变异和亲缘性关系分析,并分析比较全基因组序列中各基因型组间和组内的遗传距离。分别使用BioEdit和BEAST软件做同源性和进化分析。研究结果1.本研究共纳入1021例SARI病例,64.38%咽拭子标本检出至少1种病毒阳性。病毒性病原谱鉴定结果如下:流感病毒阳性率为19.78%,呼吸道合胞病毒（HRSV）为19.39%,并居首位,其次为鼻病毒（9.58%）和副流感病毒（9.32%）。5岁以下儿童以HRSV感染为主,5岁以上人群以流感病毒感染为主。各病毒混合感染率达15.84%。2.HMPV阳性率为7.05%。2岁以下儿童HMPV阳性率最高,5岁以下儿童占HMPV感染的84.72%。HMPV主要在10月到次年5月流行,并且在3月～5月出现流行高峰。临床表现以上呼吸道感染表现为主,主要引起支气管肺炎。3.本研究共完成43株G基因全长扩增,其基因型鉴定分布如下:A亚型中A2b基因型1例、A2c基因型31例,B亚型中B1基因型5例、B2基因型6例,未检出A1和A2a基因型。4.对本研究获得的31株HMPV A2c基因型序列与A2c基因型原型株（Genebank号JX082176）进行比对,结果显示:31株A2c基因型病毒序列中,有22株病毒序列在G基因出现了 111个核苷酸片段的重复插入,在进化树中与日本A2b111 nt-dup序列形成独立分支;另有6株病毒序列在G基因出现了180个核苷酸片段的重复插入,在进化树中与日本、西班牙、克罗地亚等地流行的A2b180nt-dup聚集在一起。依据基因亲缘性关系和最新的参考文献,本研究将全球发现的所有含有111和180个核苷酸片段的重复插入变异株统一命名为HMPV A2c111 nt-dup和A2c180nt-dup重复插入变异株。这两种变异株的G蛋白上分别增加37个或60个氨基酸,插入区域分别增加12-13个或25个O糖基化位点。B亚型未出现重复插入变异情况。5.本研究挑选一株含有1 1 1个核苷酸片段重复插入的变异株,即A2c111nt-dup变异株（标本号:SA20180159）,进行全基因组序列扩增,序列分析结果证实其基因组全长为13.45kb。在整个基因组中,除G基因有1 1 1个核苷酸重复序列插入外,其他部分未发生插入或缺失变异情况。SA20180159变异株与三株日本流行的含有1 1 1个核苷酸片段重复插入变异株相比,核苷酸序列高度同源,为 99.26%～99.33%。6.对全基因组不同基因片段的核苷酸变异程度研究结果发现:G蛋白编码基因核苷酸序列同源性均值为61.2%,低于SH基因（77.9%）和其它基因（86.20%～90.07%）,表明在全基因组序列中G蛋白编码基因变异最大。7.本研究获得的A2c111 nt-dup变异株,即SA20180159变异株,与全球不同国家和地区流行的HMPV全基因组序列代表株进行亲缘性关系分析,结果显示:基于全基因组与各蛋白基因编码区（除M2-1外）构建的进化树,拓扑结构基本一致,均可分为6个基因型,即A1、A2a、A2b、A2c、B1、B2。研究结论1.2017年10月-2019年6月,河南省漯河市SARI住院病例呼吸道样本中,病毒性病原检出较多,病毒总阳性率为64.38%。流感和呼吸道合胞病毒是主要病原体（并居首位）,其次是鼻病毒和副流感病毒。混合感染以HRSV、流感病毒、鼻病毒常见。2.河南省漯河市SARI住院患者中HMPV,主要感染5岁以下儿童,尤其是2岁以下儿童。且随着年龄的增长,HMPV阳性率逐渐下降。流行季节在秋末到次年夏初,并在3月-5月达到流行高峰。3.河南省漯河市HMPV以A2b、A2c、B1和B2四种基因型共同循环,以A2c为优势流行基因型（82.35%）。4.本研究首次在中国发现A2c180nt-dup和A2c111 nt-dup两种重复插入变异株的流行,且这2种变异株在我国河南省漯河市于2017年-2019年逐渐成为优势流行株,BEAST分析估计其起源时间约为2009年。需要进一步在我国其他地区进行HMPV连续监测,以了解这两种变异株在我国其他地区的流行情况及进化模式。引起相似临床症状的另一种呼吸道病毒RSV的BA9和ON1基因型病毒也具有类似的重复插入变异（分别在G基因有60和72个核苷酸的重复插入）,自发现以来,BA9和ON1基因型RSV病毒在短时间内其流行范围逐步扩大至全球20多个国家。这种在HMPV出现的相似重复插入变异是否也是HMPV进化的关键模式?该重复变异是否和病毒适应性相关,从而导致该变异株在人群中的优势流行?这些关键问题均需要进一步的深入研究。5.基于全基因组及各蛋白基因编码区（除M2-1外）的基因分型结果基本一致。在整个基因组中,G基因核苷酸变异程度最高,并出现111或180个核苷酸片段的重复插入变异。通过全基因组序列分析,进一步证实G基因可用于HMPV病毒分子分型依据,能更好追溯病毒传播路径并分析HMPV基因变异变迁规律。