研究背景:肺癌是一种以肺部组织内肿瘤细胞生长失控为特征的恶性肿瘤。如果不接受有效治疗,肿瘤细胞能够迅速转移到人体其他组织与器官。目前,肺癌的发病率位居所有恶性肿瘤疾病中第二位,死亡率位居第一位。近年来,随着研究者们对肺癌的细胞遗传学特点、分子生物学机制等领域进行深入的研究,一些新型的分子靶点治疗(EGFR-TKIs药物:Osmertinib)、化学免疫治疗(CRLX101、TAS-102化疗药物)为肺癌患者获得更好的疗效与预后效果。尽管如此,肺癌的转移与侵袭现象仍然是临床上所要面临的难题。肺腺癌,恶性程度高,是最容易出现早期转移的非小细胞型肺癌。在首诊时,疾病通常已达晚期。目前,对肺腺癌转移与复发的治疗效果不理想,导致患者死亡率高,这对人类生命健康造成巨大威胁。因此,探讨肺癌的转移与侵袭机制具有十分重要的意义。蛋白质Z(Protein Z,PZ)是一种主要由肝脏产生具有抗凝血作用的血浆糖蛋白因子。生理状态下,它与蛋白质Z依赖的蛋白酶抑制剂(Protein Z dependent protease inhibitor,ZPI)形成复合物在血液中循环。PZ作为ZPI的辅助因子,在ZPI抑制FXa的过程中发挥抗凝作用并能够使抗凝作用提升1000倍。在PZ缺乏的情况下,ZPI抑制FXa的作用减弱,凝血活性增强,容易增加体内血栓形成风险。已有研究报道,在胃癌、结肠癌、肺癌等恶性肿瘤组织中发现PZ及其m RNA表达。我们前期的实验研究发现,PZ的血浆水平随着恶性实体瘤病程的进展而明显下降,这提示PZ可能是肿瘤患者预后不良的因素之一。而我们最新研究发现PZ在肺腺癌组织及细胞中表达,这与之前报道的文献结果一致,这意味着PZ与恶性肿瘤之间可能存在着更深层的关系。然而,PZ在恶性肿瘤中表达是否对肿瘤本身的生长及转移或者其他生物学发面发挥作用,目前尚不清楚。本实验拟在前期探索性研究的基础上,主要通过细胞分子生物学实验,探讨PZ对肺腺癌转移及生长的影响,并初步探讨PZ对肺腺癌转移的作用机制,为临床上肺腺癌的疾病诊治提供一定理论依据。目的:1.了解PZ在肺腺癌中的表达情况。2.探讨PZ对肺腺癌细胞的迁移、侵袭、增殖与凋亡的影响。3.初步探讨PZ在肺腺癌转移机制中的作用。研究方法:一免疫组织化学、蛋白质印迹方法分别检测肺腺癌组织、肺腺癌细胞中PZ的表达1、免疫组织化学方法检测肺腺癌组织中PZ的表达:完成收集肺腺癌组织标本,标本收集来自未曾经过放疗及化疗的患者。用免疫组化方法将30例肺腺癌和16例癌旁病理组织标本染色,观察染色情况检测肺腺癌及癌旁组织中PZ的表达。收集数据并完成统计分析,比较PZ在肺腺癌与癌旁组织中的表达情况。2、蛋白质印迹方法检测肺腺癌细胞中PZ的表达:实验细胞分别采用ACC212102、A549、SPCA-1三种人源肺腺癌细胞系进行培养。收集对数生长期细胞,冰冻PBS轻柔冲洗细胞代谢产物,加入RIPA裂解液,放置冰上充分裂解,低温超速离心提取细胞蛋白质。利用BCA方法检测蛋白浓度,严格按照Western blot操作流程完成整个实验过程。收集数据并完成统计分析,了解PZ在不同肺腺癌细胞系上的表达情况,并筛选出在强表达PZ的肺腺癌细胞系。二合成靶向沉默目的基因PZ的si RNA,并转染入A549肺腺癌细胞系,方法检测沉默效果根据第一部分中Western blot方法检测肺腺癌细胞中的PZ表达结果,筛选出PZ表达效果最强的A549肺腺癌细胞系培养并进行下一步实验。收集对数生长期细胞,并将其分为5组,分别是:空白对照Mock组、无效序列阴性对照si RNA-NC组,实验组si RNA-PZ001、002、003(三组)。严格按照si RNA试剂盒操作说明书完成实验操作。将靶向目的基因si RNA脂质载体转染入A549肺腺癌细胞中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24-96小时,收集目的蛋白。BCA方法检测蛋白浓度,Western blot方法检测转染效果。收集数据并完成统计分析,对比转染前后PZ在肺腺癌细胞中的表达情况,筛选最有效沉默PZ的靶向序列,为下一步细胞实验:划痕实验、细胞迁移、侵袭实验、细胞增殖及凋亡实验准备。三划痕实验、Transwell方法分别检测si RNA转染前后A549细胞迁移及侵袭能力变化1、划痕实验检测沉默PZ前后的A549细胞迁移能力:收集对数生长期细胞,并分为3组,分别是:空白对照Mock组、阴性对照si RNA-NC组,实验组si RNAPZ组。选取6孔板并在底部标记横线,将3组细胞分别接种适量细胞到孔中,过夜长满单层细胞,用小枪头垂直背后划痕,PBS轻柔冲洗去除划下的细胞,加入无血清培养液,置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养,0小时、24小时、48小时取样拍照。收集数据并完成统计分析,对比对照组与实验组结果,了解PZ对肺腺癌细胞迁移能力的影响。2、Transwell方法检测沉默目PZ前后的A549细胞迁移及侵袭能力:收集对数生长期细胞,并分为3组,分别是:Mock组、si RNA-NC组,si RNA-PZ组。根据A459细胞的直径,选择孔径为0.8um的Transwell小室。将3组细胞分别接种适量细胞到上层小室中并加入无双抗无胎牛血清的培养液,下层为含有20%胎牛血清的培养液(若实验为侵袭实验,则在接种细胞前需要先在小室的上室中按比例铺一层基质胶),置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养24小时后取出,甲醇固定,0.1%结晶紫染色,棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,显微镜下观察细胞。收集数据并完成统计分析,对比对照组与实验组结果,了解PZ对肺腺癌细胞迁移、侵袭转移能力的影响。四蛋白印迹方法检测PZ对细胞间质化肿瘤转移机制作用收集对数生长期细胞,分为3组:Mock组、si RNA-NC组与si RNA-PZ组。对三组肺腺癌细胞同时检测Slug、Vimentin、N-cadherin三种蛋白。收集数据并进行统计分析,对比三组之间Slug、Vimentin、N-cadherin三种蛋白表达差异,了解PZ对肺腺癌细胞间质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)转移机制的作用。五CCK-8方法检测si RNA转染前后A549细胞的增殖变化情况收集对数生长期细胞,分为3组:Mock组、si RNA-NC组与si RNA-PZ组。选择96孔板,将不同组细胞分别接种到小孔中,每次实验每组细胞均接种至5个孔中,并放置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养24小时后,每个孔加入10ul CCK溶液,并于细胞培养箱中培养12小时、24小时、48小时、72小时,并分别检测对应时间点的吸光度值。收集数据并进行统计分析,对比不同时间点三组之间细胞增殖情况,了解PZ对肺腺癌细胞增殖能力的影响。六流式细胞方法检测si RNA转染前后的A549细胞凋亡坏死变化情况分别选取已被si RNA-PZ转染及没有被转染的A549细胞。收集对数生长期细胞,分为2组:对照Control组与实验si RNA-PZ组。将各组细胞消化、离心收集5×10^5个细胞,取500ul 1×Binding Buffer重悬细胞,然后每管加入5ul Annexin V-FITC和10ul PI,轻柔涡旋之后,室温避光孵育5分钟,放置在流式仪上分析。收集数据并进行统计分析,对比两组细胞之间的结果,了解PZ对肺腺癌细胞凋亡的影响。结果:一PZ在肺腺癌组织及肺腺癌细胞中高表达1.免疫组化实验结果显示:PZ在肺腺癌组织中表达明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。2.Western blot实验结果显示:PZ分别在ACC212102、A549、SPCA-1三种不同的肺腺癌细胞中均有表达。PZ蛋白在A549细胞中表达尤为突出。A549细胞与SPCA-1、ACC212102两种肺腺癌细胞相比,PZ的表达量差异均有统计学意义(P<0.05)。二si RNA有效沉默PZ并筛选效果最佳效序列经过si RNA脂质体转染后,si RNA-PZ001组与Mock组及si RNA-NC组相比,si RNA-PZ001中的PZ在表达水平明显下降。差异有统计学意义(P<0.001),提示si RNA脂质体靶向沉默PZ基因有效,可以进行下一步实验;而Mock组与si RNA-NC组细胞中PZ的表达,差异无统计学意义(P>0.05)。三si RNA-PZ组细胞迁移及侵袭能力较靶向沉默前明显下降1.划痕实验结果发现:si RNA-PZ组肺腺癌细胞与Mock组及si RNA-NC组细胞迁移速度比较,无论是在24小时还是48小时后,si RNA-PZ组细胞向中线运动迁移速度明显缓慢,差异均有统计学意义(P<0.05)。抑制PZ表达能够抑制A549细胞的迁移,这提示PZ表达在A549细胞中可能参与并且有助于肺腺癌细胞的迁移运动。而Mock组与si RNA-NC组细胞迁移速度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.Transwell迁移及侵袭实验结果发现:无论在迁移实验还是侵袭实验中,si RNA-PZ组肺腺癌细胞与Mock组及si RNA-NC组比较,穿过Transwell小室膜的细胞数目明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。抑制PZ表达能够抑制A549细胞迁移及侵袭能力,这提示PZ在肺腺癌细胞中表达,能够促进肺腺癌细胞的迁移能力,有助肺腺癌细胞的转移。而Mock组与si RNA-NC组比较,穿过小室膜的细胞数目差异无统计学意义(P>0.05)。四PZ可能通过EMT途径影响A549细胞的迁移及侵袭利用Western blot检测与细胞间质化转移途径相关蛋白Slug、Vimentin及Ncadherin三种蛋白结果发现:si RNA-PZ组与Mock组、si RNA-NC组相比较,Slug、Vimentin及N-cadherin三种蛋白表达均下降,差异均有统计学意义(P<0.05),这提示PZ的表达能够影响Slug、Vimentin及N-cadherin蛋白的表达,初步提示了PZ可能通过作用EMT通路影响肺腺癌细胞的转移。五PZ可能不参与A549细胞增殖CCK-8实验结果发现:si RNA-PZ组、Mock组、si RNA组三组细胞增殖情况无明显差异,差异无统计学意义(P>0.05),这提示PZ蛋白的表达可能不参与肺腺癌细胞的增殖过程。六PZ可能不影响A549细胞的凋亡流式细胞术检测细胞凋亡实验结果发现:si RNA-PZ组、Mock组、si RNA组三组细胞凋亡与坏死情况均无明显差异,差异均无统计学意义(P>0.05),这提示PZ蛋白的表达不参与肺腺癌细胞的凋亡过程,对肺腺癌细胞的凋亡与坏死无影响。结论:1.PZ蛋白在肺腺癌组织与肺腺癌细胞中均出现高表达,临床标本检测提示PZ表达可能与肺腺癌发生、发展相关。2.通过细胞生物学实验与分子实验证实PZ与肺腺癌的迁移与侵袭呈正相关。3.PZ蛋白可能通过EMT影响肿瘤转移。4.PZ蛋白的表达可能不参与肺腺癌细胞的增殖过程。5.PZ蛋白的表达不参与肺腺癌细胞的凋亡过程,对肺腺癌细胞的凋亡与坏死无影响。