近年来,随着人口老化、环境污染、全球气温上升,越来越多的人出现皮肤色素失调性疾病。寻找更安全、更有效的新型外用皮肤美白祛斑剂是当今化妆品的研究热点之一。细胞因子与黑素细胞之间的关系已成为美白研究的另一重要方向。在皮肤,内皮素(endothelins, ET)表达于角质形成细胞,内皮素受体(endothelin receptor, EDNR)则表达于黑素细胞。已证实,ET可与黑素细胞膜上的内皮素受体相互作用并通过酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase-related protein-1, TRP-1)、MAPK、PKC、PKA和酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,KIT)这六条信号通路促进黑素细胞的增殖和黑素生成。因此,内皮素系统作为角质形成细胞和黑素细胞相互作用的桥梁,参与黑素细胞的增殖和黑素合成等过程,而内皮素拮抗剂可以通过拮抗ET的作用而抑制黑素细胞增殖及合成黑素。已有报道证实白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种非肽类内皮素拮抗剂。我们推测,RES作为一种内皮素拮抗剂可能从酪氨酸酶、TRP-1、MAPK、PKC、PKA和KIT这六条信号通路拮抗ET-1诱导的黑色素生成,从而达到美白祛斑的作用。本课题主要目的是研究RES对ET-1介导的黑素细胞黑素合成的影响及其相关机制,并探讨其对黑素细胞的细胞毒性作用,为RES作为一种新型、安全和高效的皮肤美白祛斑物质提供一定的理论基础和实验依据。为了使该项研究顺利地完成,我们将整个实验细分为四个实验,分别是:①建立不含佛波醇酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA)和霍乱毒素(cholera toxin,CT)体外培养正常人黑素细胞的方法:以避免TPA和CT改变黑素细胞的生物学特性,为后续的实验提供可靠的黑素细胞来源。②研究ET-1对培养的人黑素细胞生物学特性的影响:探讨ET-1对体外培养的正常人黑素细胞形态、增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成的影响,并寻找一个最有效的调控浓度,为后续的实验提供实验基础。③RES对人黑素细胞的细胞毒性分析:以探讨RES应用于美白祛斑治疗的安全性,并寻找出其安全浓度范围,为其临床应用提供实验依据。④探讨RES对ET-1介导的黑素合成的影响及其相关机制:以探讨RES应用于美白祛斑治疗的有效性,并初步研究其相关机制,为其临床应用提供实验依据。针对以上四个实验目的,我们的实验方法和结果如下:首先,在第一项实验研究中,我们取了青少年包皮环切术后包皮组织6例,年龄6-11岁,平均8岁,用不含TPA和CT的角质形成细胞无血清培养基(KC-SFM)培养、用差速贴壁法及胰酶差速消化法去除角质形成细胞、用两段法去除成纤维细胞,所培养出的细胞经多巴染色和抗S-100、抗HMB45蛋白抗体免疫细胞化学染色均呈阳性反应,证实为黑素细胞,从而建立了不含TPA和CT体外培养正常人黑素细胞的方法,该方法稳定、可靠。其次,在第二项实验研究中,我们取了青少年包皮环切术后包皮组织6例,年龄6-15岁,平均11岁,分别用倒置显微镜观察、CCK-8法、多巴氧化法和NaOH法测定了ET-1对黑素细胞形态、增殖、酪氨酸酶活性和黑素含量的影响。该项实验结果提示:一定浓度的ET-1可有效地促进培养的正常人黑素细胞的增殖和树突形成,上调酪氨酸酶活性和增加黑素含量,10 nM的ET-1不仅能促进黑素细胞增殖及酪氨酸酶活性,而且此浓度下的黑素含量水平最高,因此10 nM是最有效的调控浓度。再次,在分析RES对人黑素细胞的细胞毒性作用时,我们取了青少年包皮环切术后包皮组织3例,年龄6-12岁,平均10岁,用CCK-8法测定黑素细胞的增殖抑制率,Annexin V/PI双染色法流式细胞仪检测黑素细胞的凋亡率。该项实验结果显示,10μM浓度以下的RES对人黑素细胞无增殖抑制作用也无凋亡促进作用。最后,在研究RES对ET-1介导的黑素合成的影响及其相关机制中,我们取了青少年包皮环切术后包皮组织9例,年龄6-15岁,平均12岁,采用NaOH法测定黑素含量,多巴氧化法测定黑素细胞的酪氨酸酶活性,半定量RT-PCR法测定酪氨酸酶mRNA和TRP-1 mRNA表达水平。我们的实验结果提示:0.1~10μM的RES可抑制ET-1介导的黑素合成,其主要机制可能是通过抑制酪氨酸酶活性起作用,而与酪氨酸酶mRNA和TRP-1mRNA的表达无关。我们的实验结果表明,RES可作为一种内皮素拮抗剂,可以通过抑制酪氨酸酶活性减少黑素合成,且在10μM浓度以下时无细胞毒性作用。因此,RES可作为一种皮肤美白物质,其安全、有效的浓度范围是0.1~10μM。