研究背景周围动脉疾病(Peripheral arterial disease,PAD)指外周动脉狭窄或闭塞引起的肢体缺血性疾病。主要包括：下肢动脉硬化闭塞、糖尿病足、血栓性脉管炎等,是一种较常见的致残性疾病。随着我国饮食结构的改变(摄入含脂食物增多)、生活工作节奏加快、人均寿命延长,PAD发病率逐年升高,己经成为危害人类健康的严重疾病。目前PAD的主要治疗手段包括：戒烟调脂、控制血糖血压、抗血小板药物治疗等；对于症状严重的患者,经皮腔内血管成形术及外科手术成为一种治疗选择,但是对于血管病变弥漫、尤其是合并糖尿病的患者往往没有手术机会,仍缺乏令人满意的治疗方法。继续探寻新的PAD治疗手段有重要的临床意义及社会价值。血管发生(neo vascularization)包含血管新生(angiogenesis)和小动脉形成(arteriogenesis)。血管新生(angiogenesis)是指血管网上芽生出来毛细血管,缺血、缺氧能够促进血管新生；而血流切应力(fluid shear stress,FSS)是动脉生成的一个重要始动因素。FSS是指在血液流动方向的切平面上,血液与血管壁之间的相互作用力。在猪急性股动脉闭塞的模型中,在闭塞远端人为造成动-静脉瘘,可以促进更多侧支循环的建立,在改善局部缺血组织血供明显优于促血管生长因子的作用,这证明缺血组织的血流切应力的持续增加能够显著促进局部小动脉形成。动脉生成表现为小动脉直径和数目的增加,这个过程是通过内皮和平滑肌细胞的增殖而不仅仅是简单的血管扩张,其中肌动蛋白Cofilinl和Cofilin2参与平滑肌细胞的迁移和增殖,循环中的单核细胞对动脉生成的过程至关重要。鉴于血流切应力增加是动脉生成的一个重要始动因素,那么增加血流切应力的药物将可能是治疗组织缺血的一个重要治疗环节。在不改变驱动压的情况下,向流体中加入极少量的某些高分子聚合物后,流体的粘滞度和密度无明显改变,但流体阻力明显降低,流速增加。这种现象称为Tom’s效应(Tom’s effect),而这些高分子聚合物常被称为“减阻剂”(Drag reducing polymers,DRPs)。近年来减阻剂在医学领域倍受关注,已先后证明减阻剂“聚氧化乙烯(polyethylene,PEO)"能够明显减少大鼠血管阻力,增加微动脉、静脉和毛细血管的红细胞速度。本课题组亦通过声学造影证实PEO可降低大鼠肢体循环阻力,当股动脉急性闭塞后,减阻剂仍可明显改善缺血肢体局部血流灌注状态表明DRPs可以提高缺血组织的血供状况,为急性缺血疾病治疗提供新的思路,并为进一探讨DRPs恢复慢性缺血组织血供提供了基础。目前已有实验证明,减阻剂通过增加血流切应力可明显减少猪、兔等主动脉粥样斑块的形成,那么它能否通过增加血流切应力等途径促进血管新生呢?在血管新生的过程中,DRPs又是通过什么样的作用机制来实现这一过程的呢?本实验拟采用大鼠慢性后肢缺血模型,结合血流动力学监测、对比超声声学造影成像技术及病理、免疫组化、microCT、Real-time PCR及扫描电镜技术,力图证明“减阻剂”可促进动脉生成(arteriogenesis)、改善缺血组织预后,并探讨其可能的机制,为建立缺血疾病治疗新手段奠定基础。第一部分减阻剂对大鼠慢性后肢缺血腹主动脉血流量及后肢阻力血流动力学的影响目的评价周期性治疗后PEO对慢性后肢缺血大鼠腹主动脉血流量及后肢循环阻力的影响,确定减阻的能效关系,为进一步开展减阻剂在慢性给药模型研究中奠定方法学基础。方法1.减阻剂的制备结合本课题组既往研究基础及国外相关研究报告,本实验选择的减阻剂种类为聚氧化乙烯(Polyethylene oxide,PEO,平均分子量为5×106Da)。称取PEO100mg,加入生理盐水100ml(浓度为0.1%,即质量浓度为1000ppm)：磁力搅拌器置入烧杯中匀速(60r/min)搅拌24h；分子截留量为50000Da的透析袋中透析24h；0.2μm的无菌过滤器过滤细菌及杂质；稀释为50ppm的溶液备用。2.动物模型的制备采购大鼠后,适应性饲养饲养1周。将实验大鼠按照完全随机的方法分为实验组及对照组,每组8只。建立大鼠慢性静脉给药模型：3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,右侧颈部切口,分离颈静脉,插入PE50管约1cm至右心房出口,用探针将PE50管经皮下隧道引导至背部切口,固定,1cm的细钢丝封堵PE50管末端。分笼饲养,每日予肝素生理盐水(10IU/ml×0.1ml)冲管。建立大鼠右侧后肢缺血模型：沿大鼠右侧后肢腹股沟韧带切口,分离股动脉及其分支,并以5-0丝线在旋髂浅动脉之上双线结扎股动脉主干,避免伤及静脉及神经。左侧后肢不做处理,作为自身内对照。给药方式：缺血后当日开始在清醒自由活动状态下通过颈静脉通道给药,隔日一次,连续给药21天,实验组予PEO(50ppm,0.8-1.2ml/h,30min)给药速度根据大鼠体重的6%计算血容量,使血药浓度达到2μg/ml,对照组以相同条件给予生理盐水。3.血流动力学监测给药后第21天行腹正中切口,分离腹主动脉,安置11ransonic超声血流仪于髂总动脉分叉处上方约5mm处,监测腹主动脉血流。经右侧股动、股静脉逆行插管至髂总动脉分叉处,监测髂动脉及髂静脉压力。后肢循环阻力通过公式：阻力=(髂动脉压力一髂静脉压力)/腹主动脉血流量,即R=△P/Flow来估算。结果1、两组大鼠腹主动脉血流量存在交互效应(F=3.076,P=0.000,提示两组间差异在不同时间下存在不同；组间差异有统计学意义(F=85.196,P=0.000),提示不同处理组的效果有差异；各时间点差异有统计学意义(F=3.47,P=0.000)提示在不同时间下两组比较血流量不同。进一步比较发现：基础状态下两组大鼠腹主动脉血流量差异无统计学意义(4.47±0.60vs4.47±0.95ml/min,t=0.016,P=0.988).减阻剂组腹主动脉血流量在给药过程中明显增加,约8min达到峰值,并维持一个平台,随后缓慢下降,各时间点血流量变化有统计学意义(F=5.995,P=0.000)。盐水组在给药过程中腹主动脉血流量变化无统计学意义(F=0.158,P=1.000)2、两组大鼠后肢循环阻力不存在交互效应(F=1.117,P=0.359);组间差异有统计学意义(F=22.17,P=0.000),提示不同处理组的效果有差异；各时间点差异没有统计学意义(F=1.165,P=0.135)提示在不同时间下后肢循环阻力没有显著性变化。进一步比较发现,基础状态下两组大鼠后肢循环阻力差异无统计学意义(0.44±0.10Vs0.43±0.04mmHg·min/ml,t=0.29,P=0.78).PEO组减阻效果明显,后肢循环阻力在给药过程明显降低,约14-18min达到最大效应,并维持稳定,停药后缓慢恢复,各时间点阻力变化没有统计学意义(F=1.632,P=0.173)。盐水组在给药过程中后肢循环阻力变化不大,无统计学意义(F=0.216,P=0.95)。结论减阻剂PEO能够增加大鼠慢性缺血后肢模型腹主动脉血流量,增加局部血流,同时降低大鼠后肢循环阻力。第二部分：减阻剂对大鼠慢性缺血后肢血管新生的影响目的1.应用超声造影评价微循环的方法,观察PEO对慢性缺血骨骼肌微循环的作用,并结合病理、免疫组化及microCT技术从不同角度评价减阻剂对大鼠慢性下肢缺血模型血管新生的影响。2.以盐水组为对照,评价PEO治疗组对缺血肢体毛细血管和小动脉的不同影响,探讨血管新生(angiogenesis)和动脉形成(arteriogenesis)在PEO促新血管生成过程中的不同作用。方法1.减阻剂的制备、动物模型的建立及给药方式同第一章。2.声学造影评价大鼠后肢骨骼肌微循环及数据分析使用Sequoia512超声心动图仪,于术前0天及术后第1、7、14、21天行对比超声评价大鼠缺血侧后肢的微循环灌注情况。超声探头固定于大鼠后肢中部短轴切面,采用相干脉冲序列成像技术(coherent pulse sequence,CPS),时间触发成像取图。连续录取造影剂再充盈至稳态过程的全部动态资料。脱机使用MCE软件分析图像,记录A、p及A×β值。根据造影剂在局部组织的声强度与时间间隔的函数关系Y=A(1-e(-β*t))超声微泡的再灌注充填曲线。造影剂再充填速率(p),反映的是微泡在局部组织毛细血管流动的速度；骨骼肌的平台声强度(A),反映的是局部微循环血流容积；两者乘积Axp也就反映局部组织血流量。3.病理学检测于术前0天,第7天,第14天及第21天分别处死动物,取下右侧后肢内收肌,行HE染色、α-actin抗体及CD31抗体免疫组化染色。4. Micro CT血管造影术后第21天,对两组大鼠腹腔麻醉,近端结扎腹主动脉近肾动脉侧,向远端插入PE50管至髂总动脉开口处,经PE50管向腹主动脉远端推注硝酸甘油200mg,1min后以60%含碘造影剂(碘海醇)3ml手动推入。用中科恺盛公司X-线成像系统对左髂总动脉至肢体末端的测值循环血管进行成像。取缺血肢体中部进行图像保存并进行定量分析。使用Image J软件对血管积分进行分析,血管积分=缺血侧总造影剂血管充填长度/非缺血侧总造影剂血管充填长度。结果1.PEO组血流灌注恢复速度显著快于盐水组。在第14天时,PEO组的血流量(A×β)恢复已经显著快于盐水组(4.94±0.82vs3.46±1.13,t=2.596, P=0.027).治疗21天时,PEO组大鼠缺血后肢的血流量高于盐水对照组,PEO组的血流恢复到术前的(90.9±17.9)%,而盐水组仅恢复到(73.3±29.4),两组比较有显著性差异(5.57±1.15vs4.09±1.04dB/s,t=2.343, P=0.001);骨骼肌血流容积(A)较生理盐水组各时间点比较无明显改变((F=0.045,P=0.836)；血流速度(β)呈现与血流量(A×β)相似变化趋势,在第14天及21天时与盐水组比较明显升高,分别为和(0.22±0.04vs0.16±0.04s-1, t=2.666, P=0.024)(0.26±0.05vs0.19±0.05s-1,t=2.734, P=0.021)差异有显著性意义。2.HE染色提示：大鼠缺血后肢骨骼肌细胞形态正常,无充血、水肿,PEO组及盐水组的骨骼肌细胞中均有炎症细胞浸润,PEO组炎症细胞浸润细胞较盐水组明显。3. a-actin免疫组化示PEO组的小动脉个数在第7天时与生理盐水组未见显著性差异(29.83±6.8vs27.42±5.72,t=0.666, P=0.52),第14天及21天时较盐水组增加,分别为(40.78±5.45vs33.01±4.66个/mm2,t=2.653, P=0.024)和(47.10±6.04vs43.18±6.47个/mm2,t=2.588,P=0.027)4.CD31毛细血管密度提示：治疗7天时,PEO组阳性染色毛细血管数明显增加,与术前相比较,有统计学意义(359.17±21.74vs312.33±21.42, P=0.006),术后14天呈现缓慢回落趋势,到第21天监测A值与术前相比较无统计学差异(314.17±26.19vs312.33±21.42,P=0.906)。生理盐水组与PEO组毛细血管密度变化趋势基本一致。两组之间各个时间点比较未见显著性差异(P>0.05)。5.‘CT造影示治疗21天后,PEO组侧支血管血管积分较生理盐水组增加(1.42±0.16vs1.16±0.16,t=2.83,P=0.018),两组相比有统计学意义。结论1.PEO能够促进大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注,增加血流速度,结合病理学及micro CT下肢血管造影,证明减阻剂PEO可以促进缺血后侧支循环血管形成过程,并可能为治疗周围血管疾病提供了一种的新型安全有效手段。2.PEO能够促进缺血下肢血管新生,其形式主要通过促进小动脉生成,而非促进毛细血管新生来这一过程来实现的。第三部分减阻剂对慢性大鼠下肢缺血血管新生的可能机制目的采用RT-PCR及扫描电镜评价减阻剂PEO对慢性缺血大鼠后肢Cofilinl和Cofilin2基因、单核细胞粘附因子(MCP-1)及单核细胞的粘附能力的影响,进一步探讨PEO促进血管新生的可能机制。方法1.减阻剂的制备、动物模型的建立及给药方式同第一章。2.肌肉Cofilin1mRNA及Cofilin2mRNA表达的测定治疗第21天后,收集肌肉组织标本,Cofilin1mRNA. Cofilin2mRNA的表达量采用实时荧光定量(RT-PCR)进行相对定量检测(以2-△△CT表示)。3.肌肉MCP-1mRNA表达的测定同本部分Cofilin1mRNA及Cofilin2mRNA的测定方法。4.扫描电镜：治疗21天时,取结扎段以下5mm处动脉标本,纵行剖开展平生理盐水冲洗去除表面附着物后,置于戊二醛固定液中,以备制作电镜标本用。扫描电镜下观察、拍照。结果1.PEO组肌肉Cofilin1mRNA与生理盐水组相比较表达显著升高(1.81±0.69vs1.00±0.00,t=2.88, P=0.035),两组比较有显著性差异。2.与生理盐水组相比较PEO组肌肉Cofilin2mRNA的表达降低(0.64±0.33vs1.00±0.00,t=2.62,P=0.026),两组比较有显著性差异。3.PEO组肌肉MCP-1mRNA与生理盐水组相比的表达增加(2.01±0.57vs1.11±0.42,t=3.09,P=0.01),两组比较有显著性差异。4.扫描电镜示PEO治疗组表面见大量单核细胞粘附,聚集成团,可见部分单核细胞侵入内膜中层。盐水组：其表面可见单核细胞及细胞碎片粘附,未见成团聚集单核细胞。结论1.减阻剂能够上调Cofilin1mRNA的表达,下调Cofilin2mRNA表达,其促进大鼠慢性缺血下肢血管新生的作用可能通过参与平滑肌细胞的迁移和增殖,促进侧枝血管发育和成熟的过程。2.减阻剂可能通过提高切应力介导的生物-机械力作用,作用于内皮细胞,提高MCP-1的表达,提高单核细胞的粘附和侵入能力,以此促进血管新生的过程。