胸苷磷酸化酶(Thymidine Phosphorylase，TP)(E．C．2．4．2．4)在体内可特异性的催化胸苷生成胸腺嘧啶和1-磷酸-2-脱氧核糖。近年来的研究表明1-磷酸-2-脱氧核糖在细胞内的衍生物——2-脱氧-D-核糖是一种内皮细胞的化学趋化因子和血管生成诱导因子，因此它除了在核苷酸补救合成途径中扮演重要的角色外，还有促血管生成的活性。研究表明，胸苷磷酸化酶在许多肿瘤组织中都有异常的高表达，是促进肿瘤血管生成和肿瘤转移的一个重要因素。Furtulon(5’-DFUR)和Capecitabine(fluoropyrimidine)等5-FU的前药，在体内只有被胸苷磷酸化酶转变成5-FU才能最终起作用。同5-FU相比，它们对于胸苷磷酸化酶高表达的肿瘤细胞有着极高的靶向性。国外有关胸苷磷酸化酶的研究一直围绕着胸苷磷酸化酶在肿瘤组织中的高表达，以及研究胸苷磷酸化酶促血管生成的机制和在肿瘤抗血管生成治疗中的应用。至于，胸苷磷酸化酶在肿瘤组织中的特异性高表达的机制和胸苷磷酸化酶在肿瘤抗血管生成治疗中应用价值的评估却很少有研究涉及。本研究在参照国外有关胸苷磷酸化酶的研究基础上，设计并完成了以下几部分研究工作： 南京医科大学硕士学位论文1．在原核系统中表达并纯化人胸菩磷酸化酶；制备、 纯化及鉴定兔抗人胸旮磷酸化酶多克隆抗体。2．研究对比具有不同增殖能力的细胞中胸菩磷酸化 酶的表达是否有差异。采用 RTP C R和免疫印迹 的方法分别研究胸菩磷酸化酶在胆囊癌、胆管癌 和正常胆囊组织中的表达；采用免疫组化的方法 研究胸旮磷酸化酶在胃癌和肺癌浸润部位和非浸 润部位的表达；采用RTPCR和免疫组化的方法 分别研究痰痕疙瘩和正常皮肤组织中成纤维细胞 胸菩磷酸化酶的表达。3．从体内和体外两种角度的研究中对比胸菩磷酸化 酶表达的差异，进而探讨体内微环境是否对胸菩 磷酸化酶的表达有影响。采用 RTI C R、免疫印迹 和免疫组化的方法分别研究胸菩磷酸化酶在痰痕 疙瘩和正常皮肤组织及原代培养的疯痕疙瘩和正 常皮肤成纤维细胞中的表达。七研究胸菩磷酸化酶在肿瘤组织中高表达可能的调 控机制。在体外细胞培养实验中，模拟体内肿瘤 微环境中胸旮升高的现象，进而研究胸旮对胸菩 磷酸化酶表达的影响。5．研究低血管生成的部位胸菩磷酸化酶是否高表 达。采用 RTP C R、免疫印迹和免疫组化的方法分 别研究胸菩磷酸化酶在胆囊癌、胆管癌和疯痕疙 瘩组织中的表达。6．研究胸菩磷酸化酶在多种细胞中的分泌表达。体 外培养多种细胞，检测上清中胸菩磷酸化酶的表 达。7．构建了人胸旮磷酸化酶的正义和反义真核表达载 三 南京医科大学硕士学位论文 体，制备胸蔷磷酸化酶的重组腺病毒表达载体。研究方法和结果：1．采用 p Q E和 p E T融合蛋白表达系统，在大肠杆菌B L上，J MIO 9中表达 N－末端带有 6个连续组氨酸的重组人胸菩磷酸化酶，蛋白产物通过 N iN TA亲和层析系统纯化。所构建的原核表达载体已通过鉴定，在大肠杆菌 B L 21、J MIO 9中得到高效表达（2 0刁 0O）并纯化（电泳纯）。2．取纯化的重组人胸旮磷酸化酶分别免疫LCR，J、鼠及家兔，制备兔和鼠抗人胸旮磷酸化酶多克隆抗体。采用金黄色葡萄球菌蛋白A 亲和层析系统纯下匕兔和鼠抗人胸旮磷酸化酶抗血清，ELISA法测定抗体的滴度。兔和鼠抗人胸旮磷酸化酶抗血清的滴度分别达到1：10 万和1：3．2万。3．采用 ＊IP＊R、免疫印迹和免疫组化的方法分别研究胸菩磷酸化酶mRNA 和蛋白在多种组织中的表达。疯痕疙瘩组织中胸旮磷酸化酶mRNA和蛋白水平均高于正常皮肤组织。胆囊癌、胃癌、肺癌和肝癌组织中胸旮磷酸化酶的表达高于癌旁组织，并且在肿瘤浸润部位的表达高于非浸润部位。4．体外原代培养分别从瘸痕疙瘩和正常表皮中分离的成纤维细胞；研究疯痕疙瘩及正常表皮中成纤维细胞的胸菩磷酸化酶活性和蛋白表达的变化。胸旮磷酸化酶表达水平在瘸痕疙瘩和正常表皮中分离的成纤维细胞中并无明显变化．5．研究胸菩对胸菩磷酸化酶表达的影响。胸菩可以上调胆管癌细 月 株卯C－939和肝癌细 月 株BEL－74O2中胸 南京医科大学硕士学位论文苦磷酸化酶的表达。6．采用ELISA和免疫沉淀结合免疫印迹的方法检测胸旮磷酸化酶在多种细胞中的分泌表达。在多种肿瘤细胞株的培养上清中均发现不同程度的胸旮磷酸化酶分泌表达。7．构建人胸苦磷酸化酶的真核表达系统，转染胆管癌细胞株QBC－939。综合以上的研究工作和结果，我们得出以下两方面的结论： a）胸旮磷酸化酶在肿瘤组织中特异性高表达的调控 困素有：1）微环境因素，包括?