目的：　　 TLR4介导信号通路在中性粒细胞介导的炎症反应中起到重要作用。超纯化的LPS刺激中性粒细胞后，可选择性激活TLR4及下游重要蛋白，继而激活重要的调节因子NADPH复合体，产生超氧阴离子，进一步活性氧族。TLR4下游重要通路为MyD88依赖通路，包括重要因子如MyD88，IL-1，IRAK以及TRAF6。丙泊酚是一种常用的静脉麻醉剂，还具有一定抗炎抗氧化作用。研究表明丙泊酚在临床浓度下(50μM)具有明显的抗炎作用。一些研究表明，丙泊酚可以明显抑制中心粒细胞的呼吸爆发作用及ROS。同时丙泊酚还可通过抑制中性粒细胞TLR4受体表达。但是丙泊酚对TLR4通路下游重要蛋白的表达具有影响作用不清楚。在本研究中，我们将观察丙泊酚TLR4其下游重要蛋白MyD88和TRAF6活性表达以及对活性氧产生的影响。　　 方法：　　 一、中性粒细胞的提取和纯化抽取10ml人静脉血，并立即置于已经肝素化的试管中，缓慢摇匀。与PBS缓冲液按1∶1混匀后，缓慢加到Ficoll分离液液面上。进行离心分离。然后通过中性粒细胞纯化试剂盒对细胞进行磁性纯化。对中性粒细胞膜表面标记CD16-PE和CD66b-FITC，通过流式仪检测纯度。通过台盼蓝染色计数细胞的活性。二、中性粒细胞转染用EP管离心得到中性粒细胞团，加入100μL的转染液重悬细胞，然后加入TRIF或MyD88 siRNA溶液（终浓度50nM）混匀。应用Nucleofecfion技术按说明书进行瞬时转染。通过阴性对照siRNA转染中性粒细胞，表达载体绿色荧光蛋白，用荧光显微镜或流式细胞仪确定转染率。直接检测目的蛋白的表达及磷酸化水平，来观察转然后基因抑制效率。三、流式检测通过特殊染料CM-H2DCFDA来检中性粒细胞内活性氧的水平。同时，为了排除细胞凋亡对各组细胞活性氧产生的影响，我们PI/annexin V方法检测了中性粒细胞的凋亡。结果通过flowjo软件分析。四、Western blotassay将获得的细胞团用细胞裂解液于冰上裂解充分。通过SDS-PAGE电泳分离方法进行蛋白的分离。转至PVDF膜上。然后置于封闭液中室温2小时。TBST洗涤2遍各5min。然后加入相应的一抗4℃过夜。然后洗涤并加入二抗室温孵育2小时。然后浸在在ECL发光液进行发光鉴定。　　 结果：　　 中性粒细胞凋亡及药物的细胞毒性对ROS产生可有影响。我们在一系列处理之后首先检测的中性粒细胞的凋亡情况，从而排除中性粒细胞凋亡和丙泊酚细胞毒性对中性粒细胞的影响。结果显示，与单独应用LPS组相比，各复合丙泊酚(10μM、50μM、100μM、150μM)组的凋亡比率为约23.4％，没有明显差异。可排除凋亡和细胞毒性对中性粒细胞ROS产生的影响。我们在空转对照组、MyD88中分别检测PPF对LPS诱导的ROS产生量。与空转对照组相比，MyD88沉默组中丙泊酚对ROS产生的抑制作用较为明显(P＜0.05)。为了验证PPF对中性粒细胞内的ROS产生的抑制作用是否与MyD88依赖通路有重要关系，我们在进行相同处理之后检测其通路中重要蛋白MyD88和TRAF6的表达情况。结果所示，丙泊酚可以下调LPS诱导中性粒细胞内MyD88和TRAF6表达。与空转对照相比，在MyD88的沉默与丙泊酚对LPS诱导的MyD88和TRAF6抑制作用具有协同作用。　　 结论：　　 1、在短时间内不同浓度丙泊酚（10μM、50μM、100μM、150μM）对中性粒细胞没有细胞毒性，不影响细胞的凋亡。可排除凋亡和细胞毒性对中性粒细胞ROS产生的影响。2、MyD88表达不足可以影响ROS的产生，并可以加重丙泊酚对中性粒细胞ROS的抑制作用。3、在LPS诱导的中性粒细胞中，临床浓度丙泊酚对MyD88和TRAF6的表达具有明显的抑制作用。以上表明，丙泊酚抑制LPS诱导中性粒细胞ROS释放可能通过抑制TLR4下游的重要蛋白因子MyD88/TRAF6实现。