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目的:构建人白细胞介素10(hIL-10)的原核表达载体,应用大肠杆菌表达hIL-10,并加以纯化,应用于小鼠气道过敏性炎症反应模型,研究外源性重组人白细胞介素10(rhIL-10)在过敏性炎症中的作用。 方法:抽取健康成人外周血,分离得到外周血单个核细胞(PBMC),应用刀豆素A(Con-A)刺激培养24小时,然后抽提细胞总RNA。通过RT-PCR方法扩增hIL-10cDNA,将hIL-10cDNA定向克隆于原核表达载体pBAD/gⅢA,应用PCR方法、酶切分析和序列测定筛选鉴定阳性克隆。培养筛选出的阳性克隆,应用阿拉伯糖诱导表达hIL-10,并进行初步纯化。实验小鼠雾化吸入诱导表达的rhIL-10,观察其在小鼠气道过敏性炎症中的作用。实验小鼠分为3 组,皆于第1、10天腹腔内注射20μg鸡卵蛋白加2mg的Al(OH)3,并于第22、23、24天作如下处理:预防组,致敏前24小时和05小时分别吸入rhIL-10(10ng);治疗组,致敏后20分钟吸入rhIL-10(10ng),对照组,致敏后20分钟吸入PBS 2ml。对实验小鼠进行观察:第26天处死动物,用1ml PBS进行支气管肺泡灌洗,计数灌洗液中的细胞数量并进行分类,利用ELISA方法检测灌洗液中的IL-5含量。支气管肺组织应用10%的甲醛固定,石蜡包埋,切片进行HE染色,观察各组小鼠组织切片中炎症细胞的浸润情况。 结果:经DNA测序证实,克隆的hIL-10cDNA与文献报道的一致,应用ELISA方法检测证明在大肠杆菌中成功表达出了hIL-10,含量>400pg/ml,检测其生物学活性与标准品无明显差异。应用hIL-10于实验小鼠发现,在治疗组和预防组支气管肺泡灌洗液中,炎症细胞较对照组明显减少,而以嗜酸细胞和中性粒细胞的减少最为明显。而预防组与治疗组相比,又以预防组的炎症细胞减少为著。而在病 — ———理切片中,预防组和治疗组支气管壁内炎症细胞的浸润较对照组少。治疗组和预防组灌洗液中IL—5 的含量较对照组明显为低,预防组和治疗组差异不明显。 结柏:纲胞因子在炎症反应的调节中起重要作用,由于 IL—10的抗炎和免疫抑制作用,本文设想应用 IL—10治疗支气管哮喘。我们构建了 hIL八 0的原核表达载体 pBADlhIL—10,并且发现外源性rhIL—10可以抑制小鼠支气管肺泡灌洗液中 IL—5的产生,这可能是由于 IL—10具有抑制炎症细胞在炎症局部浸润的特性。对 rhIL刁 0进行进一步纯化,可望应用于某些炎症性疾病的治疗。