随着纳米技术不断成熟,纳米材料的种类日渐增加。纳米二氧化钛（titanium dioxide nanoparticles,nano-TiO₂）具有特殊的物理化学特性,在食品添加剂、食品包装材料、药物和化妆品中均有应用。经口暴露的纳米TiO₂进入人体后,到达肠道,与肠道细胞接触。肠上皮细胞是肠道中组成物理性肠道屏障的重要成员。肠上皮细胞间的一系列紧密连接蛋白构成连续环状带,这种紧密连接结构能阻止病原性有害物质通过肠道进入机体循环,维护机体健康。然而,现阶段纳米TiO₂与肠屏障中紧密连接蛋白相关的研究缺乏。因此,探索纳米TiO₂对肠上皮细胞紧密连接蛋白的影响对纳米TiO₂在现实中合理应用具有重要意义。基于纳米TiO₂材料的普遍性和肠道紧密连接蛋白于人体的重要性,本研究以肠上皮细胞作为研究对象,分析纳米TiO₂对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响。同时,测定纳米TiO₂作用的肠上皮细胞中炎症因子分泌水平并进行相关的作用机制研究,为评价纳米TiO₂颗粒的安全性应用提供一定理论依据。本实验内容分为以下三部分:第一部分:纳米TiO₂颗粒表征目的:对纳米TiO₂进行表征,分析纳米TiO₂的粒径、分散系数及Zeta电位。方法:采用透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）分析纳米TiO₂的形貌;动态光散射法（dynamic light scattering method,DLS）测定纳米TiO₂颗粒平均水合粒径大小、分散系数及Zeta电位。结果:TEM法所得图像显示纳米TiO₂颗粒呈球形。DLS法测定分散于培养基中的纳米TiO₂颗粒的平均水合粒径为64.59±2.05 nm,分散系数PDI为0.23±0.01,Zeta电位为-11.4±0.8 mV。第二部分:纳米TiO₂对IEC-6细胞紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平及炎症因子分泌的影响目的:探究纳米TiO₂对IEC-6细胞中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平及炎症因子的分泌水平的影响。方法:1.设立对照组（纳米TiO₂浓度为0.0μg/mL）和染毒组,染毒组中分别以浓度为5.0,10.0,15.0,20.0,40.0,60.0μg/mL纳米TiO₂对IEC-6细胞染毒24 h,采用噻唑蓝（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT）吸光度比较法测定各组IEC-6细胞的存活率,确定染毒浓度。2.采用蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）测定对照组和纳米TiO₂（5.0,10.0,15.0,20.0μg/mL）染毒组Occludin和ZO-1蛋白表达水平。3.采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定对照组和纳米TiO₂（5.0,10.0,15.0,20.0μg/mL）染毒组中白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一氧化氮合酶（iNOS）的分泌水平。结果:1.MTT法实验结果表明,纳米TiO₂导致IEC-6细胞存活率降低,且细胞存活率与纳米TiO₂浓度呈现负相关关系（r=-0.767,P<0.001）。与对照组相比,IEC-6细胞存活率在纳米TiO₂浓度为40.0μg/mL和60.0μg/mL时下降且具有统计学差异（P<0.05）。2.WB法实验结果表明,Occludin和ZO-1蛋白表达水平均随纳米TiO₂染毒浓度增加而降低(r_occludin=-0.742,P<0.01;r_zo-1=-0.744,P<0.01);与对照组相比,Occludin蛋白表达水平在各个纳米TiO₂染毒组下降,ZO-1蛋白在浓度为20.0μg/mL纳米TiO₂组中表达水平降低（P<0.05）。3.与对照组相比,纳米TiO₂染毒组IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS表达水平上升,且呈剂量—效应关系(r_IL-1β=0.870,P<0.01;r_IL-6=0.938,P<0.01;r_TNF-α=0.982,P<0.01;r_iNOS=0.982,P<0.01)。第三部分:MAPK、JAK2/STAT3信号通路在纳米TiO₂影响IEC-6细胞炎症因子分泌和紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平中的作用目的:通过探究MAPK、JAK2/STAT3信号通路在纳米TiO₂影响IEC-6细胞炎症因子分泌和紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平中的作用,探索纳米TiO₂引起IEC-6细胞紧密连接蛋白表达下降的可能原因。方法:1.采用WB法测定对照组和纳米TiO₂（5.0,10.0,15.0,20.0μg/mL）染毒组,MAPK、JAK2/STAT3蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平。2.设立对照组,U0126（10μM）抑制剂组,SB203580（10μM）抑制剂组,SP600125（20μM）抑制剂组,AG490（20μM）抑制剂组,纳米TiO₂染毒组,U0126+纳米TiO₂共同处理组,SB203580+纳米TiO₂共同处理组,SP600125+纳米TiO₂共同处理组,AG490+纳米TiO₂共同处理组（各组抑制剂在纳米TiO₂干预前30min加入）。采用ELISA法测定各组炎症因子分泌水平。3.采用WB法测定对照组,U0126（10μM）抑制剂组,纳米TiO₂染毒组,U0126+纳米TiO₂共同处理组中p-ERK和ERK蛋白表达水平;WB法测定对照组,SB203580（10μM）抑制剂组,纳米TiO₂染毒组,SB203580+纳米TiO₂共同处理组中p-p38和p38蛋白表达水平;WB法测定对照组,SP600125（20μM）抑制剂组,纳米TiO₂染毒组,SP600125+纳米TiO₂共同处理组中p-JNK和JNK蛋白表达水平;WB法测定对照组,AG490（20μM）抑制剂组,纳米TiO₂染毒组,AG490+纳米TiO₂共同处理组中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达水平。4.采用WB法分别测定上述组别中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平。结果:1.与对照组相比,随着纳米TiO₂染毒浓度增加,ERK、p38、JNK、JAK2、STAT3磷酸化蛋白水平增加;p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值较对照组增高,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.与纳米TiO₂染毒组相比,U0126（10μM）抑制剂、SB203580（10μM）抑制剂、SP600125（20μM）抑制剂和AG490（20μM）抑制剂能降低炎症因子分泌水平（P<0.05）。3.U0126（10μM）抑制剂、SB203580（10μM）抑制剂和SP600125（20μM）抑制剂能分别抑制ERK、p38和JNK磷酸化蛋白表达水平,差异均具有统计学意义（P<0.05）;AG490（20μM）抑制剂降低JAK2磷酸化蛋白水平,并同时抑制其下游通路蛋白STAT3磷酸化蛋白的表达,与纳米TiO₂染毒组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.WB法测定结果表明,在纳米TiO₂染毒之前给予IEC-6细胞ERK信号通道抑制剂U0126（10μM）、p38通道抑制剂SB203580（10μM）、JNK通道抑制剂SP600125（20μM）以及JAK2/STAT3通道抑制剂AG490（20μM）均能增加紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平,与纳米TiO₂染毒组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:纳米TiO₂作用于肠上皮IEC-6细胞,导致细胞间的紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平降低和细胞炎症因子分泌水平增加。MAPK与JAK2/STAT3信号通路对于纳米TiO₂引起肠上皮IEC-6细胞炎症因子分泌水平增加和紧密连接蛋白降低具有重要作用,肠上皮IEC-6细胞中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平降低可能与炎症因子对肠上皮细胞的刺激有关。