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随着纳米技术不断成熟,纳米材料的种类日渐增加。纳米二氧化钛(titanium dioxide nanoparticles,nano-TiO2)具有特殊的物理化学特性,在食品添加剂、食品包装材料、药物和化妆品中均有应用。经口暴露的纳米TiO2进入人体后,到达肠道,与肠道细胞接触。肠上皮细胞是肠道中组成物理性肠道屏障的重要成员。肠上皮细胞间的一系列紧密连接蛋白构成连续环状带,这种紧密连接结构能阻止病原性有害物质通过肠道进入机体循环,维护机体健康。然而,现阶段纳米TiO2与肠屏障中紧密连接蛋白相关的研究缺乏。因此,探索纳米TiO2对肠上皮细胞紧密连接蛋白的影响对纳米TiO2在现实中合理应用具有重要意义。基于纳米TiO2材料的普遍性和肠道紧密连接蛋白于人体的重要性,本研究以肠上皮细胞作为研究对象,分析纳米TiO2对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响。同时,测定纳米TiO2作用的肠上皮细胞中炎症因子分泌水平并进行相关的作用机制研究,为评价纳米TiO2颗粒的安全性应用提供一定理论依据。本实验内容分为以下三部分:第一部分:纳米TiO2颗粒表征目的:对纳米TiO2进行表征,分析纳米TiO2的粒径、分散系数及Zeta电位。方法:采用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)分析纳米TiO2的形貌;动态光散射法(dynamic light scattering method,DLS)测定纳米TiO2颗粒平均水合粒径大小、分散系数及Zeta电位。结果:TEM法所得图像显示纳米TiO2颗粒呈球形。DLS法测定分散于培养基中的纳米TiO2颗粒的平均水合粒径为64.59±2.05 nm,分散系数PDI为0.23±0.01,Zeta电位为-11.4±0.8 mV。第二部分:纳米TiO2对IEC-6细胞紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平及炎症因子分泌的影响目的:探究纳米TiO2对IEC-6细胞中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平及炎症因子的分泌水平的影响。方法:1.设立对照组(纳米TiO2浓度为0.0μg/mL)和染毒组,染毒组中分别以浓度为5.0,10.0,15.0,20.0,40.0,60.0μg/mL纳米TiO2对IEC-6细胞染毒24 h,采用噻唑蓝(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)吸光度比较法测定各组IEC-6细胞的存活率,确定染毒浓度。2.采用蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)测定对照组和纳米TiO2(5.0,10.0,15.0,20.0μg/mL)染毒组Occludin和ZO-1蛋白表达水平。3.采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定对照组和纳米TiO2(5.0,10.0,15.0,20.0μg/mL)染毒组中白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮合酶(iNOS)的分泌水平。结果:1.MTT法实验结果表明,纳米TiO2导致IEC-6细胞存活率降低,且细胞存活率与纳米TiO2浓度呈现负相关关系(r=-0.767,P<0.001)。与对照组相比,IEC-6细胞存活率在纳米TiO2浓度为40.0μg/mL和60.0μg/mL时下降且具有统计学差异(P<0.05)。2.WB法实验结果表明,Occludin和ZO-1蛋白表达水平均随纳米TiO2染毒浓度增加而降低(roccludin=-0.742,P<0.01;rzo-1=-0.744,P<0.01);与对照组相比,Occludin蛋白表达水平在各个纳米TiO2染毒组下降,ZO-1蛋白在浓度为20.0μg/mL纳米TiO2组中表达水平降低(P<0.05)。3.与对照组相比,纳米TiO2染毒组IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS表达水平上升,且呈剂量—效应关系(rIL-1β=0.870,P<0.01;rIL-6=0.938,P<0.01;rTNF-α=0.982,P<0.01;riNOS=0.982,P<0.01)。第三部分:MAPK、JAK2/STAT3信号通路在纳米TiO2影响IEC-6细胞炎症因子分泌和紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平中的作用目的:通过探究MAPK、JAK2/STAT3信号通路在纳米TiO2影响IEC-6细胞炎症因子分泌和紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平中的作用,探索纳米TiO2引起IEC-6细胞紧密连接蛋白表达下降的可能原因。方法:1.采用WB法测定对照组和纳米TiO2(5.0,10.0,15.0,20.0μg/mL)染毒组,MAPK、JAK2/STAT3蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平。2.设立对照组,U0126(10μM)抑制剂组,SB203580(10μM)抑制剂组,SP600125(20μM)抑制剂组,AG490(20μM)抑制剂组,纳米TiO2染毒组,U0126+纳米TiO2共同处理组,SB203580+纳米TiO2共同处理组,SP600125+纳米TiO2共同处理组,AG490+纳米TiO2共同处理组(各组抑制剂在纳米TiO2干预前30min加入)。采用ELISA法测定各组炎症因子分泌水平。3.采用WB法测定对照组,U0126(10μM)抑制剂组,纳米TiO2染毒组,U0126+纳米TiO2共同处理组中p-ERK和ERK蛋白表达水平;WB法测定对照组,SB203580(10μM)抑制剂组,纳米TiO2染毒组,SB203580+纳米TiO2共同处理组中p-p38和p38蛋白表达水平;WB法测定对照组,SP600125(20μM)抑制剂组,纳米TiO2染毒组,SP600125+纳米TiO2共同处理组中p-JNK和JNK蛋白表达水平;WB法测定对照组,AG490(20μM)抑制剂组,纳米TiO2染毒组,AG490+纳米TiO2共同处理组中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达水平。4.采用WB法分别测定上述组别中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平。结果:1.与对照组相比,随着纳米TiO2染毒浓度增加,ERK、p38、JNK、JAK2、STAT3磷酸化蛋白水平增加;p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值较对照组增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.与纳米TiO2染毒组相比,U0126(10μM)抑制剂、SB203580(10μM)抑制剂、SP600125(20μM)抑制剂和AG490(20μM)抑制剂能降低炎症因子分泌水平(P<0.05)。3.U0126(10μM)抑制剂、SB203580(10μM)抑制剂和SP600125(20μM)抑制剂能分别抑制ERK、p38和JNK磷酸化蛋白表达水平,差异均具有统计学意义(P<0.05);AG490(20μM)抑制剂降低JAK2磷酸化蛋白水平,并同时抑制其下游通路蛋白STAT3磷酸化蛋白的表达,与纳米TiO2染毒组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.WB法测定结果表明,在纳米TiO2染毒之前给予IEC-6细胞ERK信号通道抑制剂U0126(10μM)、p38通道抑制剂SB203580(10μM)、JNK通道抑制剂SP600125(20μM)以及JAK2/STAT3通道抑制剂AG490(20μM)均能增加紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平,与纳米TiO2染毒组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:纳米TiO2作用于肠上皮IEC-6细胞,导致细胞间的紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平降低和细胞炎症因子分泌水平增加。MAPK与JAK2/STAT3信号通路对于纳米TiO2引起肠上皮IEC-6细胞炎症因子分泌水平增加和紧密连接蛋白降低具有重要作用,肠上皮IEC-6细胞中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平降低可能与炎症因子对肠上皮细胞的刺激有关。