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研究背景虽然医学科技不断发展,人们健康理念不断提高,心肌梗死(myocardial infarction, MI)依然是临床患者致死及致残的主要原因之一。尤其在人口老龄化及不良生活方式居多的中国,MI已成为严重公共卫生问题。急性MI后并发症是其致死及致残的的主要原因,如心律失常、心力衰竭等。心律失常作为MI常见的并发症,特别是MI后恶性室性心律失常是导致猝死的主要原因。研究发现室性心律失常及心源性猝死与交感神经密度升高有关。MI后神经生长因子(nervegrowth factor, NGF)表达增加,引起缺血坏死神经再生、增生乃至过度增生即重构现象系列研究发现直接或间接增加NGF表达可增加MI后梗死周边及非梗死区交感神经密度,并且增加室性心律失常的发生或易感性。多项实验研究表明多种药物可通过降低神经NGF表达来降低心脏交感神经密度,降低心律失常及猝死的发生率或易感性。有学者提出可从转录或转录后水平干预神经生长因子的表达来改善梗死后NGF上调带来的不利效应。但NGF同时具促血管生长,抗凋亡等心肌保护作用,甚至有学者提出可以用NGF来用于MI后心脏修复治疗。以上研究提示MI后NGF的表达具有双重效应,表现为致心律失常及保护心功能效应。RNA干扰技术自发现短短十几年以来,在微生物学研究、基因治疗、信号转导及功能基因组学研究等多个领域里取得了令人瞩目的进展。近年其在心血管疾病领域研究基因功能、靶向治疗也取得了骄人的成绩。通过RNA手段来沉默NGF对梗死心肌预后的影响是值得关注的科研课题。第一部分神经生长因子R N A干扰慢病毒载体的构建及体外沉默效果目的设计合成3对以NGF基因不同位点为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建携带沉默NGF基因不同位点的3组慢病毒表达载体,并对经鉴定纯化的载体进行包装、滴度测定,同时进行筛选,并在体外进行干预效果检测。方法设计合成3对针对NGF基因的特异性shRNA片段,退火后经Hpa Ⅰ和Xho1双酶切后,与载体进行连接,扩增后提取质粒。再经双酶切鉴定和测序后,将测序正确的载体和慢病毒包装质粒共同转染293T细胞,收集、纯化和浓缩富含慢病毒颗粒的细胞上清液。将3个候选siRNA合成的慢病毒混悬液随机分成3组转染大鼠原代胶质细胞(干扰1组、干扰2组、干扰3组)。同时设立空白对照组,观察各组细胞转染后形态和荧光的表达。经检测筛选出干扰效果最佳的siRNA。再利用慢病毒携带的靶shRNA转染大鼠心肌细胞96小时,应用Westernblot技术检测NGF蛋白的表达。RT-PCR技术检测各组细胞的NGF基因的mRNA水平。结果双酶切鉴定和测序结果均表明3组重组的shRNA干扰慢病毒载体均有一段与我们设计合成的靶向链完全一致的序列,经RT-PCR检测提示干扰2组降低NGF mRNA最为明显。体外心肌细胞实验也提示其具有较好的基因沉默效果,大量包装准备后期实验。结论成功地合成了3组沉默大鼠NGF基因的寡核甘酸序列,并构建了携带NGF基因shRNA-的慢病毒表达载体质粒,经293T细胞包装生产出高滴度的重组慢病毒,并筛选出理想的干扰siRNA,并成功进行体外心肌细胞干扰实验。第二部分心肌梗死后神经生长因子基因沉默对鼠心脏病理生理影响目的利用大鼠MI模型探讨心肌局部NGF基因干扰后心脏交感神经、血管、结构以及心功能的变化。方法通过结扎大鼠左冠前降支建立心肌梗死模型,再随机分组接受心肌内注射含NGF shRNA慢病毒液(N=19,MI.SiNGF组),含空载体慢病毒液(N=18,MI.GFP组)或0.9%的氯化钠溶液(N=18,MI-control组),或接受开胸心包切开术(N=17,shan-operated组)。在梗死后1周,2周,4周各组处理3只大鼠和观察时间终点8周观察NGF mRNA及蛋白的表达。在观察终点时间8周,先行超声检查评估心动能,随之进行血流动力学检测了解心脏功能变化,同时对比各组交感神经、毛细血管及小动脉的密度变化,并观察神经及血管生长情况。结果经过在1周,2周,4周和8周的动态观察发现,在MI-control组大鼠比sham-operated组NGF mRNA和蛋白水平均明显升高,而在MI-GFP组大鼠与MI-control组表现相似的表达水平。但与MI-GFP组相比,二者的表达水平在MI-SiNGF组均明显降低。提示慢病毒携带的NGF ShRNA心肌内注射可有效降低心肌内NGF表达。同时梗死8周,超声心动图及血流动力学提示各组心功能不全的数据在MI-SiNGF组较其他MI组有明显降低。在MI-SiNGF组大鼠梗死灶周及非梗死左室有更低的酪氨酸羟化酶(TH)和生长相关蛋白43(GAP43)阳性神经纤维。并且,与MI-GFP组相比,NGF基因沉默后,心肌梗死灶周血管内皮生长因子(VEGF)表达以及小动脉和毛细血管密度均减少或降低,并且有更大的梗死面积。结论慢病毒携带的NGF shRNA抑制交感神经生长和血管生长活性,降低交感神经及毛细血管密度,扩大梗死面积,加重心脏功能障碍,研究表明通过RNA干扰直接减少心肌内NGF的表达虽然改善交感神经重构,但恶化心功能,潜在增加不良预后。