【摘 要】
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辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMOV)属烟草花叶病毒属(Tobamovirus),主要寄生于甜椒、线椒,造成辣椒减产,质量降低。基于病毒的巨大危害,本研究通过生物学方法
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辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMOV)属烟草花叶病毒属(Tobamovirus),主要寄生于甜椒、线椒,造成辣椒减产,质量降低。基于病毒的巨大危害,本研究通过生物学方法、RT-PCR技术和ELISA方法对辣椒轻斑驳病毒进行检测,并获得了一个辣椒轻斑驳病毒中国分离物的基因组全序列;此外,还分析了鲍氏层孔菌多糖的三种纯化组分对病毒增殖的影响。1、利用摩擦接种法,将辣椒轻斑驳病毒接种于烟草叶片,接种烟草叶片出现花叶、褪绿、褶皱、卷曲、坏死斑症状。利用RT-PCR技术,分别利用两对引物对辣椒轻斑驳病毒进行了扩增,获得了预期片段,并经测序证明其为病毒特异片段。利用AGDIA的DAS-ELISA检测试剂盒对辣椒轻斑驳病毒进行了检测,该试剂盒可有效检测辣椒轻斑驳病毒。2、建立了基于干燥叶片提取总RNA的技术体系。该体系首先在65℃下干燥辣椒或者烟草叶片,再采用CTAB法提取核酸,可有效提取出辣椒或烟草总RNA。获得的RNA条带清晰,无拖尾。以此总RNA为模板,可有效且稳定地扩增出大于2000bp病毒部分基因组片段。3、利用RT-PCR技术,获得了一个辣椒轻斑驳病毒中国分离物的基因组全序列。该序列全长6294bp,比GenBank中辣椒轻斑驳病毒分离物全基因组少63个核苷酸。包含四个开放阅读框,推测分别编码183KDa、126KDa、28KDa、17KDa蛋白质。本研究中获得的分离物与日本分离物亲缘关系较近,与已报道的可破坏辣椒L3抗性基因的分离物亲缘关系较远,推测本研究中获得的分离物不能破坏辣椒L3抗性基因。4、经过离子交换层析纯化,将鲍氏层孔菌粗多糖分为三个部分,分别命名为PIP30-Ⅰ、PIP60-Ⅰ、PIP8O-Ⅰ。将辣椒轻斑驳病毒分别接种烟草植株,利用DAS-ELISA分析鲍氏层孔菌多糖处理对辣椒轻斑驳病毒接种及增殖的影响。结果显示,多糖组分PIP8O-Ⅰ、PIP30-Ⅰ有钝化该病毒的作用,无抑制或者治疗作用。PIP60-Ⅰ多糖对辣椒轻斑驳病毒无钝化、抑制或者治疗作用。
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