基于纳米金标记和杂交链式反应的高灵敏生物分析方法研究

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核酸扩增信号放大技术由于其超强的核酸扩增能力,已经被广泛应用在了核酸、蛋白质、小分子、细胞等生物分子的高灵敏检测中。杂交链式反应(HCR)是一种无酶、等温、扩增效率高、操作简单的核酸扩增技术,比较于热循环扩增技术和基于酶反应的等温扩增技术,其具有可以在等温条件下进行、无需酶的参与等优势,越来越多的被应用于生物分子的信号放大检测中。金属纳米粒子由于其独特的物理化学性质而拓宽了其在生物信号识别和信号转导方面的应用。特别是纳米粒子包含大量金属原子的特征,激发了人们利用纳米粒子设计新型信号放大策略的灵感。电感耦合等离子体质谱(ICPMS)是一种灵敏度高、线性范围广、检出限低、能同时测定多种元素且能实现绝对定量的理想的元素测定仪器,基于ICPMS检测的稳定同位素标记策略近几年来发展迅速,被广泛应用在生物分子的高灵敏检测中。本论文提出了一种基于纳米金标记和杂交链式反应的高灵敏核酸和蛋白质的检测方法。将纳米粒子标记技术和核酸扩增技术在信号放大方面的优势相结合,并利用ICPMS检测金离子信号,建立起灵敏度高、线性范围宽、特异性好的核酸和蛋白质的检测方法。在核酸检测中,目标DNA通过杂交互补配对与捕获DNA结合,被固定在磁珠上。而目标DNA作为引物,将引发杂交DNA进行HCR扩增,通过生物素和链霉亲和素之间的相互作用,将链霉亲和素修饰的纳米金连接在扩增后的修饰有生物素的双链DNA上,随后将纳米金消解成金离子,用ICPMS对金离子信号进行检测,通过金离子信号强度和目标DNA含量之间所具有的的线性关系,实现对目标DNA的高灵敏检测。本方法对于目标DNA的检出限为0.56 amol,线性范围为10 amol-10~6 amol,血清样品中的加标回收率在89-108%之间,表明本方法对于临床样品的检测具有潜在的应用价值。在蛋白质检测中,通过目标抗原与捕获抗体的特异性结合,将目标抗原固定在磁珠表面。利用纳米金易于生物功能化的特点,同时在纳米金表面修饰抗体和DNA,其中修饰的抗体和目标抗原结合,形成“三明治”结构,修饰的DNA作为引物,激发HCR扩增。一个纳米金表面能够修饰多条DNA,可以同时引发多个HCR反应。通过生物素和链霉亲和素之间的反应,在HCR形成的双链DNA上连接多个纳米金粒子,用酸将纳米金消解成金离子,用ICPMS检测金离子信号。通过确定金离子信号与目标蛋白含量之间的线性关系,实现对目标蛋白质的高灵敏检测。最终对人IgG的检出限为2.0 pg/mL,线性范围为0.01-1 ng/mL,真实血清样品中目标蛋白的回收率在95-115%之间,体现出本方法可以很好地应用在真实样品的检测中。本方法对多种生物分子的同时高灵敏检测技术的发展具有一定的参考价值。
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