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脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是临床上中老年人的常见病、多发病,具有高死亡率和高致残率的特点。脑水肿是脑出血最重要的并发症之一,其发生发展直接关系到患者的预后,因此脑水肿的形成机制一直是神经科学研究的重点内容。脑水肿发生的关键是脑细胞内、外水电解质分布失衡,从而破坏了脑细胞内环境的稳定和结构的完整性。水通道蛋白家族(aquaporins,AQPs)的发现,为进一步阐明脑内水电解质运输平衡及其异常的分子机制提供了新契机。AQPs是一类介导水分子高速跨膜转运的细胞膜通透蛋白,其在中枢神经系统水电解质平衡中发挥了重要作用。水通道蛋白4 (aquaporin4,AQP4)是目前发现的脑内表达最丰富的水通道蛋白。生理情况下,AQP4密集表达在脑实质与脑脊液／血液交界处的星形胶质细胞终足膜上,参与构成胶质界膜,其在维持脑内动态水平衡中发挥了重要作用。研究者们将AQP4在星形胶质细胞终足膜上密集表达的这一分布模式称之为AQP4的“极性表达”(polarized expression)。进一步研究发现,星形胶质细胞终足膜上的AQP4以正交序列(orthogonal arrays of particles,OAPs)的形式存在,OAPs是AQP4行使其高效水转运功能的结构基础。生理条件下,AQP4极性表达在与水转运密切相关的星形胶质细胞终足膜上,对维持血脑／血脑脊液间水电解质平衡具有至关重要的作用；而在病理情况下,AQP4极性表达障碍,OAPs的形成亦明显降低,AQP4的高效水转运功能障碍,引起血脑／血脑脊液间水平衡紊乱。AQP4极性表达与肌萎缩蛋白-肌营养不良聚糖蛋白复合物(dystrophin-dystroglycan complex, DDC)密切相关。DDC复合物是一组连接细胞外基质分子与细胞骨架的相互作用蛋白,其成员包括Dystroglycan(DG),dystrobrevin和syntrophin,核心成员为DG(包括α-DG与p-DG)。β-DG是跨膜分子,在细胞外经α-DG与细胞外基质连接,在细胞内与细胞骨架连接,并通过a-syntrophin将AQP4极性锚定到星形胶质细胞终足膜上。研究发现,DG基因敲除后,血管周围星形胶质细胞终足膜上的AQP4极性表达缺失,提示其在AQP4极性定位中发挥了重要作用。对于ICH这种常见病、多发病,目前的研究集中在ICH脑组织中AQP4表达量的变化上,而对AQP4极性表达是否变化,极性表达变化是否与出血性脑水肿相关,目前尚未见报导。为此,本课题拟应用自体血注入法建立ICH动物模型,研究AQP4极性表达变化对出血性脑水肿发生发展的影响,以及研究AQP4的锚定蛋白β-DG对AQP4极性表达变化的影响,以期为脑水肿形成的分子机制研究提供实验基础以及为脑水肿治疗提供新思路。研究目的1.研究AQP4在ICH脑组织中的表达变化,以及AQP4极性表达变化对出血性脑水肿发生发展的影响；2.研究DDC复合物的核心成员β-DG与AQP4在ICH脑组织中的表达变化,以初步探讨β-DG对AQP4极性表达变化的影响。研究内容与方法健康成年雄性SD大鼠204只,随机分为假手术对照组(sham组)与ICH组(ICH后1 d、3 d、7 d)。采用自体血注入法建立大鼠ICH动物模型,应用核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)检测血肿产生及发展,干湿重法检测脑水含量变化,伊文斯兰(Evans Blue,EB)注入法检测血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性改变,透射电镜和HE染色检测组织病理结构变化,免疫印迹和实时荧光定量PCR检测血肿周围组织中AQP4蛋白及其mRNA表达变化,免疫荧光双标记检测AQP4的极性表达变化,免疫荧光双标记检测AQP4与β-DG的共表达变化,免疫印迹和实时荧光定量PCR检测血肿周围组织中β-DG蛋白及其mRNA的表达变化。结果1.ICH脑组织中AQP4极性表达缺失MRI检测显示所有模型组均有明显的边界清楚的血肿,ICH后1d的血肿直径最大,表明50μl自体血注入大鼠尾状核后,成功的建立了ICH动物模型。ICH后1d、3d的脑水含量明显增高,与sham组比较,差值具有统计学意义(P<0.05)。ICH后1d、3 d血肿周围组织中的EB含量均明显增高,与sham组比较,差值具有统计学意义(P<0.05)；HE染色和透射电镜检测发现血肿周围组织结构破坏明显,以ICH后1d为甚,可见血管周围间隙增宽,毛细血管内皮细胞胞浆肿胀,胞浆内出现小泡、小囊等结构。ICH后1 d,血肿周围组织中,AQP4蛋白与mRNA含量均明显增高,与sham组比较,差值具有统计学意义(P<0.05)；与sham比较,ICH后3 d、7 d的AQP4蛋白与mRNA含量均无明显变化,差值不具有统计学意义(P>0.05)。免疫荧光双标记结果显示,sham组中,AQP4极性表达在软脑膜下外胶质界膜、室管膜细胞基底部及其下的内胶质界膜以及尾状核毛细血管周围星形胶质细胞终足膜上；而ICH组,AQP4成团的聚集在外胶质界膜、弥散性的表达在整个室管膜细胞,以及表达到血肿周围星形胶质细胞胞体和突起上,即ICH脑组织中,AQP4极性表达缺失。2.β-DG表达下调与AQP4极性表达缺失密切相关对照组中AQP4与β-DG共表达在软脑膜下外胶质界膜、室管膜细胞基底部及其下的内胶质界膜、脑实质毛细血管周围星形胶质细胞终足膜上；而ICH组,在血肿周围组织、室管膜细胞及外胶质界膜上的AQP4极性表达缺失,同时伴随着B-DG在上述部位的表达明显降低,仅可见稀疏的、散在的位于星形胶质细胞胞体上的阳性表达。而在穹窿下器官、视上核、海马、齿状回等AQP4非极性表达部位,AQP4与p-DG仍然呈明显的共表达。ICH后1 d、3 d、7 d的血肿周围组织中,β-DG蛋白含量明显降低,与sham组比较,差值具有统计学意义(P<0.05)。ICH后1 d、3d、7d的血肿周围组织中,β-DG mRNA含量无明显变化,与sham组比较,差值不具有统计学意义(P>0.05)。结论1.自体血注入后,ICH脑组织中存在水平衡紊乱,并且本模型所诱导的出血性脑水肿主要为血管源性脑水肿；2.血肿周围组织中AQP4表达增强,但其主要表达于星形胶质细胞胞体上,而非极性表达到星形胶质细胞终足膜上,即ICH后脑组织中,AQP4极性表达缺失；3.ICH后脑组织中,伴随着AQP4的极性表达缺失,β-DG表达下调,提示p-DG表达下调与AQP4极性表达缺失密切相关；4.AQP4极性表达缺失具有重要的病理生理意义。β-DG表达下调后,AQP4难于通过p-DG与细胞外基质连接,从而不能极性定位到星形胶质细胞终足膜上；血肿周围组织中,由于血凝块回缩血浆渗出,以及毛细血管通透性增加,血管内容物渗出等原因,大量水分积聚到细胞外间隙,但此时血管周围星形胶质细胞终足膜上的极性表达的AQP4明显降低,不能及时有效的将细胞外间隙的水分快速转运进毛细血管,从而延缓了水肿的清除。即AQP4极性表达缺失可能一定程度上促进了出血性脑水肿的发展。