早产儿，特别是早产儿合并极低体重，是全球面临的健康问题，是5岁以下儿童死亡的主要原因之一。在中国5岁以下儿童的死亡原因中早产儿所占比例为17.5％，在新生儿期死亡原因中高达33％，存活者也多遗留神经功能障碍，例如精神发育迟滞，智力障碍，听视力和社交认知障碍，严重者可发生脑瘫。临床调查显示早产儿脑损伤是导致神经功能障碍的重要原因，然而临床上对早产儿脑损伤的早期发现、早期治疗手段有限，严重降低了早产儿的生存质量，给家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担。因此探讨和研究早产儿脑损伤的发病机制寻找可能的治疗靶点是亟待解决的重大问题。近年来有关免疫和炎症在早产儿脑损伤发生发展中的作用越来越引起人们的重视，成为该领域研究的热点之一。　　T淋巴细胞是机体重要的免疫细胞之一，产生于胸腺，根据细胞表面的受体(TCR)可以分为不同的亚组，多数T淋巴细胞因TCR包含一个α链和β链而被称为αβT淋巴细胞，少数T淋巴细胞因含有γ和δ链而被称为γδT淋巴细胞，占据外周血T淋巴细胞的1-5％。γδT淋巴细胞不仅具有反应快速等先天性免疫的特点，而且具有免疫调节，呈递抗原和直接杀伤的作用;同时能够识别大量抗原，包括脂类抗原，不需要MHC分子辅助。而αβT淋巴细胞主要在适应性免疫中发挥作用，需要抗原提成和激活，根据功能可以分为CD4+辅助性T淋巴细胞(Th)和CD8+细胞毒性T淋巴细胞，Th淋巴细胞根据细胞因子的不同又可以分为Th1，Th2，Th17，Th22和T调节性淋巴细胞(Treg)。　　越来越多的证据表明T淋巴细胞在成年和新生儿脑损伤的发病机制中发挥重要作用。在成年脑中风动物模型中，T淋巴细胞在脑梗死区域显著增加，而免疫缺陷或者抑制T淋巴细胞均可以减轻梗死面积的大小。而且Th1类型的炎症因子IFNγ和Th17类型的炎症因子TNFα对仅未成熟的少突胶质细胞有毒性作用。以上提示，Th1和Th17相关的炎症反应可能在早产儿脑损伤的发病机制中扮演十分重要的作用。在成年缺血性脑损伤的模型中，γδT淋巴细胞浸入大脑并分泌细胞因子IL-17A，在体外实验中γδT淋巴细胞能够直接杀死人少突胶质细胞，而缺乏γδT淋巴细胞能够缓解多发硬化动物模型的症状。αβT淋巴细胞与抗原接触才可以从幼稚状态变成有效应功能的活化细胞并分化成Th细胞，而γδT淋巴细胞与αβT淋巴细胞相比，在胚胎的胸腺中发育成熟，而且不需要抗原呈递，提示可能在生命早期的免疫反应中扮演十分重要的作用。有关γδT淋巴细胞和αβT淋巴细胞在未成熟脑损伤中的作用尚未见相关报道。　　骨桥蛋白(OPN)是一种糖蛋白，分为分泌型(sOPN)和胞内型(iOPN)两种形式，脑组织和许多免疫细胞均可分泌骨桥蛋白。sOPN还可以通过精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列与一系列的整合素结合例如α9β1，α4β1，α4β7，α5β1，αvβ1，αvβ3，αvβ5，和αvβ6相结合。iOPN作为衔接分子，可以调节固有免疫细胞受体，例如TLRs下游信号分子，是NK细胞和体内平衡的重要的调节分子，因此骨桥蛋白在细胞因子的产生、细胞的迁移、活化和黏附中发挥重要的作用。研究证实在多发硬化病人及其动物模型中，OPN扮演着十分重要的作用。OPN在成年小鼠中风后大脑损伤侧表达增强，并且给予外源性OPN能够减轻脑损伤的程度。在人类新生大脑亚急性和慢性脑白质软化缺血区周围的轴突中发现有较强的OPN的表达，提示OPN可能在早产儿脑损伤中发挥重要作用。　　综上所述研究现状，本研究将采用多种未成熟脑损伤模型/标本和转基因小鼠，基于分子生物学和神经行为学等技术手段，初步探索T淋巴细胞免疫在未成熟脑损伤中的作用和机制，并观察骨桥蛋白对未成熟脑损伤的作用和影响。　　第一部分 γδT淋巴细胞，而非IL-17/IL-22，在未成熟脑损伤中发挥重要作用　　目的:　　炎症在早产儿脑损伤及其后遗症脑瘫的发展中有重要作用，但在生命早期脑损伤后发挥重要作用的关键免疫细胞和机制目前仍不清楚。本研究将明确γδT淋巴细胞在未成熟脑损伤中的作用和机制。　　方法:　　采用新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型、胎羊缺氧缺血性脑损伤模型和早产儿尸检标本，利用基因敲除小鼠和抗体封闭的方法，研究γδT淋巴细胞和IL-17/IL-22在未成熟脑损伤中的作用。　　结果:　　在小鼠、羊和早产儿尸检脑标本中发现大量的γδT淋巴细胞浸入，敲除γδT淋巴细胞，而非敲除IL-22或者抗体封闭IL-17A/F，可以对未成熟脑损伤动物模型产生保护作用。　　结论:　　未成熟脑损伤与成熟脑损伤的作用机制可能不同，γδT淋巴细胞担任了重要的角色，但是不分泌传统的细胞因子，提示了未成熟缺氧缺血性脑损伤的独特性。因此，通过γδT淋巴细胞改善早产儿脑损伤可能成为新的治疗靶点。　　第二部分 γδT淋巴细胞，而非αβT淋巴细胞在败血症致脑白质损伤和行为障碍中发挥重要作用　　目的:　　败血症与早产儿脑白质损伤及其脑瘫的发生密切相关，在本部分中，我们使用了新生鼠败血症模型来观察T淋巴细胞亚型在败血症致脑白质损伤和远期行为学中的作用。　　方法:　　通过对早产儿尸检脑标本染色观察败血症与脑白质损伤的关系。生后2日龄C57BL/6J野生型小鼠(WT)，T淋巴细胞受体δ敲除(TCRδ-/-)和T淋巴细胞受体α敲除(TCRα-/-)小鼠皮下注射5mg/kg的脂多糖(LPS)或者其他Toll受体激动剂。利用碱性髓鞘蛋白免疫组化染色评价脑白质损伤情况。采用流式细胞术观察LPS注射后6小时，14小时，24小时，48小时，3天和7天点大脑和脾脏中树突状细胞和γδT淋巴细胞的变化。利用步态分析系统DigiGait和高空十字架分别评价运动和焦虑行为的改变。　　结果:　　早产儿尸检脑标本的免疫组化结果显示败血症导致了早产儿脑损伤。所有Toll受体激动剂均可造成野生型小鼠脑白质损伤。LPS注射后引起野生型小鼠脾脏树突状细胞和γδT淋巴细胞的激活，然后树突状细胞和gdT淋巴细胞的数目在大脑中并未增加。与野生型小鼠相比，TCRδ-/-和TCRα-/-脑白质的发育是正常的。与生理盐水组相比，LPS可以导致WT和TCRα-/-小鼠短暂的脑白质损伤，而在TCRδ-/-小鼠没有这种现象。无论是LPS还是T淋巴细胞亚型敲除均对焦虑行为没有影响。步态分析系统结果显示26天时，与生理盐水组相比，LPS造成WT和TCRα-/-小鼠的行为异常，而对TCRδ-/-小鼠无影响。　　结论:　　败血症可以导致脑白质损伤。γδT淋巴细胞在LPS致暂时性未成熟脑白质损伤和运动行为障碍中有重要作用。因此，在早产脑损伤的早期调节γδT淋巴细胞活动可能是治疗早产儿脑损伤的新的治疗方向。　　第三部分 骨桥蛋白及其肽段在未成熟脑损伤中的作用　　目的:　　骨桥蛋白(OPN)是一种高度磷酸化的糖蛋白，同时也是一种可溶性的细胞因子，在脑组织及其他很多组织中广泛表达。研究表明OPN及其肽段在成熟大脑缺氧缺血性脑损伤中具有潜在的保护作用，该部分将初步探索OPN及其肽段在缺氧缺血性未成熟脑损伤中的作用。　　方法:　　采用生后5日龄小鼠，结扎左侧颈总动脉并缺氧70分钟制作缺氧缺血性(HI)脑损伤动物模型。通过RT-PCR、蛋白印迹和免疫组化的方法观察脑组织中OPN的表达情况。在缺氧缺血前，通过侧脑室或者经鼻腔注射给药的方式给予小鼠OPN或者OPN肽段，在HI7天点灌注取脑，采用髓鞘碱性蛋白(MBP)或者微管相关蛋白-2（MAP-2）评价脑损伤的情况。　　结果:　　5日龄小鼠HI后内源性OPN在脑组织中的mRNA和蛋白的表达明显升高。通过使用侧脑室或者经鼻给药的方式证明给予全长OPN蛋白或者凝血酶消化的OPN蛋白对未成熟脑损伤没有任何影响，侧脑室注射给予OPN的肽段N134-153和C154-198均可加重脑损伤的程度。　　结论:　　OPN的神经保护作用可能具有年龄依赖性，与更成熟的脑组织相比，OPN来源的肽段能加重5日龄小鼠的脑损伤程度。此外，经鼻注射给药是一种非常有效的给予新生鼠中枢神经系统药物的方法，提示可能在将来的临床工作中经鼻注射给药可能是早产儿中枢神经系统给药的一种方式。