连翘花抑制酪氨酸酶活性及化学成分研究

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连翘(Forsythia suspensa(Thunb) Vahl)为木犀科(Oleaceae)连翘属植物。其成熟果实为一种传统中药,具有清热解毒、散结消肿之功效。连翘每年早春三月先叶开花,花期长,花量大,花色长久不褪。目前人们对连翘研究比较充分,但对连翘花的化学成分和药理活性研究较少。在化学成分方面,主要对连翘花挥发油成分进行了分析研究,从连翘花中分离鉴定出了芦丁(Rutin)、连翘酯苷A(ForsythiasideA)、连翘苷(Phillyrin)、连翘脂素(Phillygenin)、松脂素((+)-Pinoresinol)、(+)-松脂素-β-D-葡萄糖苷((+)-pinoresinol-β-D-glucoside)、连翘醇(Rengyol)、齐墩果酸(Oleanolic Acid)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、棕榈酸(Palmitic Acid)10个化合物。在药理活性方面,主要发现连翘花具有抗氧化和抗菌活性。据报道,连翘花及果实具有消除黄褐斑、蝴蝶斑等美容功效,但目前尚不清楚其中的化学物质基础和作用机制。由于连翘果实主要用于中药制药和临床处方用药,而在连翘花落期产生的大量落花被遗弃、没有被利用。因此,为了充分利用连翘花资源,本文主要以抑制酪氨酸酶活性为指导,对连翘花抑制酪氨酸酶活性不同有效部位进行了筛选,并对连翘花的化学成分进行了初步研究。具体内容如下:  1.以L-酪氨酸(L-Tyr)为底物,蘑菇酪氨酸酶(TYR)为酶,采用单因素考察法优化了酶、底物的量及反应时间,确定了酶活反应体系:130μL PBS+50μL TYR(120 U/mL)+20μL L-Tyr(0.45 mg/mL),475nm下反应30 min;利用上述体系对连翘不同器官—花、叶、果实(青翘和老翘)的水提物进行了抑酶活性评价。结果表明,连翘花水提物对蘑菇酪氨酸酶活性的抑制表现出了浓度依赖性,且在所设浓度范围内,果实(青翘和老翘)和连翘叶的最高抑制率均低于连翘花,因此,本课题以连翘花为研究对象,对其进行下一步研究。  2.采用中低压制备分离技术,对连翘花水提物(LQH-W)进行了初步分离,得到LQH-W-1、LQH-W-2、LQH-W-3、LQH-W-4、LQH-W-5五个组分。以熊果苷为阳性对照,分别测定了连翘花水提物和上述五个组分对蘑菇酪氨酸酶的抑制活性。结果发现LQH-W-2的IC50为1.175 mg/mL、LQH-W-3为1.441 mg/mL、LQH-W-4为0.668 mg/mL、LQH-W-5为1.427 mg/mL,均表现出了较好的抑酶活性。其中组分LQH-W-4的IC50与阳性对照物熊果苷(IC50:0.516 mg/mL)相近,在连翘花中表现出了最好的抑制活性,其作为天然酪氨酸酶抑制剂在美白化妆品方面有很好的应用前景。  3.为了比较全面地研究连翘花中抑制蘑菇酪氨酸酶的活性组分和活性成分,对连翘花脂溶性提取物进行了研究。利用羟丙基葡聚糖凝胶色谱(Sephadex LH-20)、MDS中低压制备和HPLC制备色谱等方法对连翘花乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物的化学成分进行了分离和鉴定。最终分离得到5个化合物,分别为连翘酯苷A(1)、芦丁(2)、(+)-pinoresinol-β-D-glucoside(3)、(+)-Pinoresinol monomethyl etherβ-D-glucoside(4)和(+)-phillyrin(5)。鉴定了三个木脂素类化合物,其中(+)-Pinoresinol monomethyl etherβ-D-glucoside为首次从连翘花中分离得到。并对(+)-pinoresinol-β-D-glucoside、(+)-phillyrin、芦丁、连翘酯苷A及分离过程中各组分进行了抑制酪氨酸酶活性测定,发现四个化合物抑酶活性较弱,未得到连翘花中起抑酶作用的主要单体成分。而aFr2和bFr4两组分抑酶活性与阳性对照物相当,作为天然酪氨酸酶抑制剂在美白化妆品方面具有很好的应用潜力。  4.采用HPLC法对连翘花、叶、果实(青翘和老翘)中(+)-松脂素-β-D-葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁和连翘苷4种活性成分进行了含量分析,并通过单因素方差分析和主成分分析对结果进行了差异性分析,表明这4种活性成分在连翘花、叶、果实(青翘和老翘)中的含量具有显著差异。  5.对连翘花乙酸乙酯提取物、95%乙醇提取物等进行了凝血酶原时间(Prothrombin Time, PT)测定,发现各种提取物对PT无显著影响。
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