论文部分内容阅读
目的：脓毒症是一种由感染因素诱发的、‘以炎症反应为主的综合症,严重时伴有脏器功能障碍,是非心脏重症监护室住院病人的最常见死因,尚无有效的治疗措施。脓毒症时血管内皮细胞被过度、持续、广泛激活,其作为炎症反应的靶细胞及效应细胞,在介导炎症反应持续的同时,其自身严重损伤,最终导致器官稳态破坏,甚至功能衰竭。因此,血管内皮细胞作为脓毒症治疗的靶点具有重要意义。氢气具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及信号调节作用,可治疗多种疾病,如缺血再灌注引起的脑、心、肝、肺、肾损伤,神经退行性疾病,糖尿病等。前期研究发现氢气吸入对脓毒症小鼠具有明显的保护作用,其具体机制尚不清楚。本文拟在前期研究的基础上,应用LPS诱导血管内皮细胞损伤,探讨含氢培养液对血管内皮细胞是否具有保护作用以及相关机制,为其临床应用提供实验和理论依据。方法：离体培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12,以1×104/mL接种于96孔培养板或以1×106/mL接种于6孔培养板,200μL/孔或3mL/孔。第一部分：分别以浓度为0μg/mL、0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL2.0μg/mL及4.0μg/mL的LPS刺激细胞,孵育24h后,采用MTT法测定细胞增殖活性,根据测定结果选择适宜的LPS刺激浓度,建立细胞损伤模型。分别以浓度为0.15mmol/L、0.3mmol/L及0.6mmol/L的含氢培养液处理细胞,测定24h后细胞活性及LDH释放率,根据结果选择最佳含氢培养液浓度。第二部分：根据第一部分实验结果,本部分实验选择LPS刺激浓度为1μg/mL,含氢培养液浓度为0.6mmol/L(饱和氢培养液)。细胞随机分为4组：正常对照组(C组)、氢气组(H2组)、LPS组和LPS+H2组。C组和LPS组用正常培养液培养；H2组和LPS+H2组用饱和氢培养液培养,同时LPS组和LPS+H2组加入1μg/mL LPS,而C组和H2组加入等容量的生理盐水。应用流式细胞术测定孵育24h后细胞凋亡及ICAM-1及VCAM-1表达情况；应用相应试剂盒测定孵育3h、6h、12h和24h后细胞上清液中MDA水平。第三部分：实验分组同第二部分。应用相应试剂盒分别测定孵育3h、6h、12h和24h后细胞上清液中SOD、CAT活性；分别应用免疫荧光及Western Blot技术检测孵育24h后Nrf2核移位及蛋白表达水平。结果：第一部分：MTT结果显示：1μg/mL浓度LPS作用24h即可引起血管内皮细胞损伤,与正常细胞比较差异有统计学意义(P<0.05)。细胞被LPS干预后,细胞生长受到抑制,LPS浓度与细胞生长抑制率成正比,接下来的实验选择LPS的刺激浓度为1μg/mL。含氢培养液对正常血管内皮细胞增值活性及LDH释放无明显影响(P>0.05),可以显著改善LPS所致血管内皮细胞活性降低及LDH释放,且呈浓度依赖性(P<0.05)。提示最佳含氢培养液浓度为0.6mmol/L,即饱和氢培养液。第二部分：采用1μg/mL浓度LPS刺激血管内皮细胞24h后,细胞凋亡显著增加,其凋亡细胞率、细胞表面ICAM-1及VCAM-1表达较C组和H2组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而LPS+H2组凋亡细胞率、细胞表面ICAM-1及VCAM-1表达较LPS组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)；于孵育后3h、6h、12h和24h,LPS组细胞上清液中MDA水平较C组和H2组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而与LPS组相比,LPS+H2组MDA水平于各时间点均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。第三部分：于孵育后3h、6h、12h和24h,LPS组细胞上清液中SOD及CAT活性较C组和H2组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),而与LPS组相比,LPS+H2组SOD及CAT活性于各时间点均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。在Nrf2免疫荧光染色中,LPS组细胞核中Nrf2荧光强度较C组和H2组无明显差别,LPS+H2组Nrf2荧光强度较LPS组显著增加。另外,与C组和H2组比较,LPS组Nrf2蛋白表达升高(P<0.05),LPS+H2组Nrf2蛋白表达则显著高于LPS组(P<0.05),而C组和H2组Nrf2蛋白表达无明显差异。结论：饱和氢培养液可有效改善LPS致血管内皮细胞增值活性降低及凋亡,抑制血管内皮细胞粘附分子表达并可显著降低氧化损伤,其机制与促进Nrf2核移位及蛋白表达,提高其下游抗氧化蛋白活性有关。