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体细胞胚胎发生(Somatic embryogenesis，SE)在农作物的遗传转化和体外快繁中发挥至关重要的作用。它是体细胞向胚胎发生方向转变的发育再建过程，是类似合子胚发育的独特现象。体胚发生过程可以在离体条件下人为控制，是细胞全能性的有力证据和经典示例。深入研究体胚发生过程的调控机理，对于阐释细胞发育、分化以及形态发生等重大科学理论问题具有重要意义。
本研究中，我们首先通过形态学、细胞遗传学和细胞化学染色的方法，系统鉴别并评估了棉花体胚发生过程中的六种不同胚性/再生潜力的愈伤细胞系。进一步围绕高低不同体胚发生能力的棉花基因型，解析了体胚发生过程中的DNA甲基化与基因表达特征。揭示了不同基因型棉花在体胚发生各个发育时期存在着不同的DNA甲基化特异修饰和基因表达调控模式。挖掘鉴定了棉花体胚发生相关的特异甲基化和差异表达基因，解析了不同基因型在体胚发生各个发育时期受DNA甲基化调控基因表达的特征和规律，进一步揭示了棉花体胚发生过程的表观调控分子机制。最后，我们基于DNA甲基化修饰和基因转录表达谱的分析，鉴定并克隆出与棉花体胚发生相关的两个重要目标基因（GhSE-1和GhSE-2），成功构建了基因超表达、RNAi干涉表达载体。通过遗传转化和阳性株系的表达分析和表型鉴定，验证了两个基因的生物学功能。主要研究成果如下:
1、在棉花长期的体外培养物中，我们筛选了六种不同胚性/再生潜力的愈伤细胞系。六种细胞系在愈伤组织的质地、颜色和团块大小等形态方面存在明显的差异。其中高胚性/再生潜力的细胞系，质地疏松、淡黄色或白色块状;而低胚性/再生潜力的细胞系，质地精细、绿色或白色致密形态。流式细胞仪(FCM)分析结果表明，六种细胞系具有稳定的染色体倍性(4C)，揭示了细胞遗传学特征与其形态发生能力无关。进一步对六种细胞系进行了醋酸洋红AC/伊文思蓝EB细胞化学双染色，愈伤中的胚性细胞被醋酸洋红染成红色，而非胚性细胞被伊文思蓝染成蓝色。化学染色法简单有效地鉴别了六种细胞系的胚性/再生能力。
通过愈伤组织的形态学、细胞遗传学和细胞化学染色特征的系统评估，我们可以在棉花组织培养物中有效地鉴别并保持具有高胚性/再生潜力的愈伤细胞系，从而实现高效的体胚发生和植株体外再生，为棉花基因工程育种应用提供优良的遗传转化受体和基础材料。
2、培养基中添加的系列不同外源生长素不仅影响愈伤组织的诱导能力、生长特性、质地、颜色和愈伤团块大小，还影响其细胞倍性水平和胚性/再生能力。其中2，4-D诱导愈伤组织的能力最强，愈伤的生长速率高、质地疏松、颜色鲜黄，但易导致体细胞变异，且体胚的再生能力较低。而IBA诱导愈伤组织的能力中等，但能保持稳定的低细胞倍性水平，不易产生体细胞变异，且最易诱导植株的体外再生。我们可以通过调整和优化培养基中2，4-D和IBA这两种激素的配比，来提高愈伤组织的诱导和植株体外再生潜力。
3、应用单碱基分辨率的全基因组甲基化测序BS-seq，揭示了高体胚发生能力基因型豫早1号(YZ)和低体胚发生能力基因型鲁棉1号(LM)在各个发育时期的DNA甲基化修饰模式，明确了不同类型的甲基化C碱基(mCG，mCHG和mCHH)在体胚发生过程中存在着不同的甲基化修饰特征，并主要分布在基因的上下游区域。其中，mCG类型的甲基化水平最高，其次是mCHG，最低的是mCHH。另外mCG类型的甲基化修饰具有基因型特异性，而mCHH类型的甲基化修饰具有发育时期特异性。
4、通过比较分析两个基因型在体胚发生各个发育时期的DNA甲基化修饰模式和位点差异，明确了启动子区域的CpH去甲基化更有利于胚性愈伤再分化，CpG去甲基化更有利于体胚发育成熟。进一步挖掘鉴定了不同发育时期的特异甲基化基因，其中在YZ愈伤组织脱分化(NEC-VS-HY)，胚性愈伤再分化(PEC-VS-NEC)，体胚再分化(GE-VS-PEC)和体胚发育成熟(CE-VS-GE)四个阶段中分别鉴定到1104，5169，1和1272个差异甲基化基因;在LM的上述四个发育阶段中分别鉴定到2033，3732，101和81个差异甲基化基因。大部分基因的甲基化修饰发生在上游启动子区域。
GO功能注释表明，在胚性愈伤再分化阶段，与YZ相比，LM中的差异甲基化基因更显著地富集于木质素代谢过程。在体胚发育成熟阶段，YZ中的差异甲基化基因在mRNA剪切负调控、细胞交流等过程显著富集，而LM中的差异甲基化基因却显著富集在芽再生和有机化合物代谢途径。
5、进一步应用转录组测序RNA-seq，分析了两个基因型在体胚发生各个发育时期的基因表达特征。明确了不同发育时期存在着六种类型的基因表达模式，其中4类型的基因对再分化过程有正向调控作用，5类型的基因对脱分化过程有正向调控作用。另外，在两个基因型体胚发生的不同时期，伴随着大量转录因子的表达动态变化，以及可变剪切和SNP变异事件。其中，数量较多的转录因子有bHLH，MYB-related，B3，NAC和WRKY等;可变剪切TSS和TTS两种类型所占的比例最高，其次为IR和AE。
6、通过比较分析两个基因型在体胚发生各个发育时期的基因表达差异，挖掘鉴定了调控棉花体胚发生过程的特异表达基因。其中在YZ愈伤组织脱分化，胚性愈伤再分化，体胚再分化和体胚发育成熟四个阶段中分别鉴定到21842，22343，9455和6909个差异表达基因;在LM的上述四个发育阶段中分别鉴定到18394，26514，7018和19529个差异表达基因。
GO功能注释和KEGG通路分析表明，在胚性愈伤再分化阶段，与LM相比，YZ中的差异表达基因更显著地富集于激素响应、染色质组装等生物过程和脂肪酸合成、同源重组等代谢过程。在体胚发育成熟阶段，与YZ相比，LM中的差异表达基因在光合作用、有丝分裂等生物过程和光合反应、细胞周期等代谢过程中更显著富集。
7、通过DNA甲基化修饰与基因表达的关联分析，明确了基因的甲基化水平与其转录表达水平呈现明显的负相关。在YZ和LM胚性愈伤再分化阶段，分别鉴定到1969和1558个受DNA甲基化调控的差异表达基因;在体胚再分化阶段，分别鉴定到180和15个受DNA甲基化调控的差异表达基因。
选取了参与棉花体胚发生过程的四个目标基因（GhSE-1、GhSE-2、GhSE-3和GhSE-4），分析了其在DNA甲基化修饰下的基因表达规律和特征，进一步揭示了棉花体胚发生过程的表观调控分子基础。其中，GhSE-1和GhSE-2基因均为跨膜蛋白，在YZ胚性愈伤再分化阶段，启动子区域去甲基化，基因上调表达;GhSE-3基因为mRNA可变剪切的负调控因子，GhSE-4基因为丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，该两类基因在YZ体胚再分化阶段，启动子区域去甲基化，基因上调表达。最后通过qRT-PCR和Methylation-sensitive HRM（甲基化特异性高分辨率溶解曲线）实验，分析了四个基因的表达模式和启动子区域的甲基化修饰水平，定量验证了测序结果的准确性。
8、基于以上DNA甲基化与基因转录表达的研究结果，我们筛选到2个与胚性愈伤分化相关的重要目标基因GhSE-1和GhSE-2。构建了该两个基因的超表达、RNAi干涉表达载体(Pro35S:GhSE-1，Pro35S:GhSE-2-GFP，Pro35S:GhSE-1-RNAi和Pro35S:GhSE-2-RNAi、)，并将其转化到陆地棉栽培种和不同体胚发生能力的棉花材料中。完成了阳性转化株系的表达分析和表型鉴定。
在棉花生长发育过程中，GhSE-1和GhSE-2基因具有相似的表达特征，均在茎和老叶中高丰度表达。功能验证结果表明，两个基因影响了棉花的茎表皮毛及叶蜡质层发育。
在棉花体胚发生过程中，GhSE-1和GhSE-2基因同样具有相似的表达模式，均在起始胚性愈伤中的表达丰度最高。功能验证结果表明，两个基因对愈伤组织诱导率和愈伤重量几乎无影响，但基因沉默后显著提高了胚性愈伤分化率和胚性细胞比例。揭示了GhSE-1和GhSE-2基因不参与棉花的非胚性愈伤诱导过程，但特异性地调控胚性愈伤分化过程。我们推测该两个基因可能作为细胞间信号转导的细胞膜蛋白，负向调控了胚性细胞的分化;另作为体细胞胚性起始再分化（细胞全能性启动）的典型分子标记，以期应用于愈伤组织中胚性细胞的早期鉴定。
目前我们正在筛选鉴定与GhSE-1和GhSE-2互作的蛋白及其上下游调控路径，进一步解析两个目标基因调控棉花体胚发生过程的生物学功能。
本研究为揭示体细胞胚胎发生的表观调控分子机制和拓展棉花遗传工程提供了重要的理论依据和基因资源，对理论研究及转基因生物技术应用均具有重要意义。
本研究中，我们首先通过形态学、细胞遗传学和细胞化学染色的方法，系统鉴别并评估了棉花体胚发生过程中的六种不同胚性/再生潜力的愈伤细胞系。进一步围绕高低不同体胚发生能力的棉花基因型，解析了体胚发生过程中的DNA甲基化与基因表达特征。揭示了不同基因型棉花在体胚发生各个发育时期存在着不同的DNA甲基化特异修饰和基因表达调控模式。挖掘鉴定了棉花体胚发生相关的特异甲基化和差异表达基因，解析了不同基因型在体胚发生各个发育时期受DNA甲基化调控基因表达的特征和规律，进一步揭示了棉花体胚发生过程的表观调控分子机制。最后，我们基于DNA甲基化修饰和基因转录表达谱的分析，鉴定并克隆出与棉花体胚发生相关的两个重要目标基因（GhSE-1和GhSE-2），成功构建了基因超表达、RNAi干涉表达载体。通过遗传转化和阳性株系的表达分析和表型鉴定，验证了两个基因的生物学功能。主要研究成果如下:
1、在棉花长期的体外培养物中，我们筛选了六种不同胚性/再生潜力的愈伤细胞系。六种细胞系在愈伤组织的质地、颜色和团块大小等形态方面存在明显的差异。其中高胚性/再生潜力的细胞系，质地疏松、淡黄色或白色块状;而低胚性/再生潜力的细胞系，质地精细、绿色或白色致密形态。流式细胞仪(FCM)分析结果表明，六种细胞系具有稳定的染色体倍性(4C)，揭示了细胞遗传学特征与其形态发生能力无关。进一步对六种细胞系进行了醋酸洋红AC/伊文思蓝EB细胞化学双染色，愈伤中的胚性细胞被醋酸洋红染成红色，而非胚性细胞被伊文思蓝染成蓝色。化学染色法简单有效地鉴别了六种细胞系的胚性/再生能力。
通过愈伤组织的形态学、细胞遗传学和细胞化学染色特征的系统评估，我们可以在棉花组织培养物中有效地鉴别并保持具有高胚性/再生潜力的愈伤细胞系，从而实现高效的体胚发生和植株体外再生，为棉花基因工程育种应用提供优良的遗传转化受体和基础材料。
2、培养基中添加的系列不同外源生长素不仅影响愈伤组织的诱导能力、生长特性、质地、颜色和愈伤团块大小，还影响其细胞倍性水平和胚性/再生能力。其中2，4-D诱导愈伤组织的能力最强，愈伤的生长速率高、质地疏松、颜色鲜黄，但易导致体细胞变异，且体胚的再生能力较低。而IBA诱导愈伤组织的能力中等，但能保持稳定的低细胞倍性水平，不易产生体细胞变异，且最易诱导植株的体外再生。我们可以通过调整和优化培养基中2，4-D和IBA这两种激素的配比，来提高愈伤组织的诱导和植株体外再生潜力。
3、应用单碱基分辨率的全基因组甲基化测序BS-seq，揭示了高体胚发生能力基因型豫早1号(YZ)和低体胚发生能力基因型鲁棉1号(LM)在各个发育时期的DNA甲基化修饰模式，明确了不同类型的甲基化C碱基(mCG，mCHG和mCHH)在体胚发生过程中存在着不同的甲基化修饰特征，并主要分布在基因的上下游区域。其中，mCG类型的甲基化水平最高，其次是mCHG，最低的是mCHH。另外mCG类型的甲基化修饰具有基因型特异性，而mCHH类型的甲基化修饰具有发育时期特异性。
4、通过比较分析两个基因型在体胚发生各个发育时期的DNA甲基化修饰模式和位点差异，明确了启动子区域的CpH去甲基化更有利于胚性愈伤再分化，CpG去甲基化更有利于体胚发育成熟。进一步挖掘鉴定了不同发育时期的特异甲基化基因，其中在YZ愈伤组织脱分化(NEC-VS-HY)，胚性愈伤再分化(PEC-VS-NEC)，体胚再分化(GE-VS-PEC)和体胚发育成熟(CE-VS-GE)四个阶段中分别鉴定到1104，5169，1和1272个差异甲基化基因;在LM的上述四个发育阶段中分别鉴定到2033，3732，101和81个差异甲基化基因。大部分基因的甲基化修饰发生在上游启动子区域。
GO功能注释表明，在胚性愈伤再分化阶段，与YZ相比，LM中的差异甲基化基因更显著地富集于木质素代谢过程。在体胚发育成熟阶段，YZ中的差异甲基化基因在mRNA剪切负调控、细胞交流等过程显著富集，而LM中的差异甲基化基因却显著富集在芽再生和有机化合物代谢途径。
5、进一步应用转录组测序RNA-seq，分析了两个基因型在体胚发生各个发育时期的基因表达特征。明确了不同发育时期存在着六种类型的基因表达模式，其中4类型的基因对再分化过程有正向调控作用，5类型的基因对脱分化过程有正向调控作用。另外，在两个基因型体胚发生的不同时期，伴随着大量转录因子的表达动态变化，以及可变剪切和SNP变异事件。其中，数量较多的转录因子有bHLH，MYB-related，B3，NAC和WRKY等;可变剪切TSS和TTS两种类型所占的比例最高，其次为IR和AE。
6、通过比较分析两个基因型在体胚发生各个发育时期的基因表达差异，挖掘鉴定了调控棉花体胚发生过程的特异表达基因。其中在YZ愈伤组织脱分化，胚性愈伤再分化，体胚再分化和体胚发育成熟四个阶段中分别鉴定到21842，22343，9455和6909个差异表达基因;在LM的上述四个发育阶段中分别鉴定到18394，26514，7018和19529个差异表达基因。
GO功能注释和KEGG通路分析表明，在胚性愈伤再分化阶段，与LM相比，YZ中的差异表达基因更显著地富集于激素响应、染色质组装等生物过程和脂肪酸合成、同源重组等代谢过程。在体胚发育成熟阶段，与YZ相比，LM中的差异表达基因在光合作用、有丝分裂等生物过程和光合反应、细胞周期等代谢过程中更显著富集。
7、通过DNA甲基化修饰与基因表达的关联分析，明确了基因的甲基化水平与其转录表达水平呈现明显的负相关。在YZ和LM胚性愈伤再分化阶段，分别鉴定到1969和1558个受DNA甲基化调控的差异表达基因;在体胚再分化阶段，分别鉴定到180和15个受DNA甲基化调控的差异表达基因。
选取了参与棉花体胚发生过程的四个目标基因（GhSE-1、GhSE-2、GhSE-3和GhSE-4），分析了其在DNA甲基化修饰下的基因表达规律和特征，进一步揭示了棉花体胚发生过程的表观调控分子基础。其中，GhSE-1和GhSE-2基因均为跨膜蛋白，在YZ胚性愈伤再分化阶段，启动子区域去甲基化，基因上调表达;GhSE-3基因为mRNA可变剪切的负调控因子，GhSE-4基因为丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，该两类基因在YZ体胚再分化阶段，启动子区域去甲基化，基因上调表达。最后通过qRT-PCR和Methylation-sensitive HRM（甲基化特异性高分辨率溶解曲线）实验，分析了四个基因的表达模式和启动子区域的甲基化修饰水平，定量验证了测序结果的准确性。
8、基于以上DNA甲基化与基因转录表达的研究结果，我们筛选到2个与胚性愈伤分化相关的重要目标基因GhSE-1和GhSE-2。构建了该两个基因的超表达、RNAi干涉表达载体(Pro35S:GhSE-1，Pro35S:GhSE-2-GFP，Pro35S:GhSE-1-RNAi和Pro35S:GhSE-2-RNAi、)，并将其转化到陆地棉栽培种和不同体胚发生能力的棉花材料中。完成了阳性转化株系的表达分析和表型鉴定。
在棉花生长发育过程中，GhSE-1和GhSE-2基因具有相似的表达特征，均在茎和老叶中高丰度表达。功能验证结果表明，两个基因影响了棉花的茎表皮毛及叶蜡质层发育。
在棉花体胚发生过程中，GhSE-1和GhSE-2基因同样具有相似的表达模式，均在起始胚性愈伤中的表达丰度最高。功能验证结果表明，两个基因对愈伤组织诱导率和愈伤重量几乎无影响，但基因沉默后显著提高了胚性愈伤分化率和胚性细胞比例。揭示了GhSE-1和GhSE-2基因不参与棉花的非胚性愈伤诱导过程，但特异性地调控胚性愈伤分化过程。我们推测该两个基因可能作为细胞间信号转导的细胞膜蛋白，负向调控了胚性细胞的分化;另作为体细胞胚性起始再分化（细胞全能性启动）的典型分子标记，以期应用于愈伤组织中胚性细胞的早期鉴定。
目前我们正在筛选鉴定与GhSE-1和GhSE-2互作的蛋白及其上下游调控路径，进一步解析两个目标基因调控棉花体胚发生过程的生物学功能。
本研究为揭示体细胞胚胎发生的表观调控分子机制和拓展棉花遗传工程提供了重要的理论依据和基因资源，对理论研究及转基因生物技术应用均具有重要意义。