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研究背景心肌梗死（MI）诱发心脏交感神经退化、坏死、再生和重塑,导致室性心律失常（VAs）并最终可能导致心源性猝死（SCD）。急性心肌梗死（AMI）诱发早期炎症反应,导致下丘脑室旁核（PVN）内的神经炎症和氧化应激反应,从而导致PVN内的神经元兴奋,并促进星状神经节（STG）重塑和炎症浸润,最终导致心脏交感神经兴奋。小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）的第一道免疫防御防线,在神经炎症中起着重要作用。Toll样受体4（TLR4）能够特异性地识别并作为重要的细菌脂多糖（LPS）内毒素的受体。TLR4在小胶质细胞中大量表达,并诱导小胶质细胞的激活。TLR4激活后与髓样分化因子88（MyD88）结合,促进核转录因子kB（NF-kB）进入细胞核,激活靶基因的转录,进而不断释放促炎细胞因子（PICs）。研究目的我们旨在通过腺相关病毒（AAV-shTLR4）抑制大鼠PVN内TLR4水平,评价MI大鼠PVN内MyD88/NF-kB信号通路蛋白表达水平,心肌和血清去甲肾上腺素（NE）水平,心率变异性（HRV）、肾交感神经活性（RSNA）、心功能及VAs易感性等指标,探究MI后PVN内TLR4/MyD88/NF-kB信号通路在交感神经过度激活中的作用。研究方法1.MI大鼠模型的建立大鼠被随机分配到5组:1d、3d、5d、7d和sham组（n=8）。在MI后1,3,5,7天,处死大鼠,收集PVN进行western blot实验检测TLR4、MyD88、NF-kB和IkB-a的蛋白表达水平。2.PVN 微注射 AAV-shTLR4病毒滴度为1x1013颗粒/ml,注射剂量为100nl/只,对照组AAV-shCtrl的注射剂量、方式与AAV-shTLR4相同。AAV-shTLR4和AAV-shCtrl微注射4周后,对大鼠进行假（sham）手术和MI造模手术。根据处理方式,大鼠被随机分为4组:sham+shCtrl组（n=20）,sham+shTLR4 组（n=20）,MI+shCtrl 组（n=20）,MI+shTLR4 组（n=20）。心脏手术后立即进行小动物遥测实验,不间断记录大鼠心电图。3天后进行RSNA测定实验,稳定后记录20分钟,再进行血流动力学检测。大鼠气管插管后,行体内程序性电刺激实验,结束后处死大鼠,回收遥测装置,收集组织。血清和左心室梗死灶灶周3 mm内的心肌组织用于酶联免疫吸附（Elisa）实验检测NE水平。PVN用于western blot实验检测TLR4、MyD88、NF-kB和IkB-a的蛋白表达水平。全脑冰冻组织用于多重免疫荧光实验检测TLR4、MyD88、NF-kB的表达与定位情况。全脑石蜡组织用于免疫组化实验检测c-fos的蛋白表达水平。研究结果1.MI 后 PVN 内 TLR4/MyD88/NF-kB 水平增加。Western blot结果显示,TLR4、MyD88、NF-kB在MI后第1天即升高,且在第3天达到最高水平,并显著高于sham组。2.抑制PVN内TLR4可抑制MyD88/NF-kB水平。Western blot和多重免疫荧光结果显示,MI后TLR4和MyD88的水平增加,NF-kB以NF-kB抑制蛋白a（IkB-a）依赖的方式发生核转位,而抑制TLR4可抑制MyD88的增加及NF-kB核转位。3.抑制PVN内TLR4可抑制MI后交感神经的激活。免疫组化结果显示,MI后PVN内c-fos水平增加,而抑制TLR4后c-fos水平降低,表明MI后中枢交感神经激活,而抑制PVN内TLR4可以抑制中枢交感神经的过度激活。HRV分析、RSNA检测、Elisa实验结果显示,LF/HF比值,RSNA和血清、心肌NE水平在MI后均升高,而在抑制PVN内TLR4后均下降,表明MI后的外周交感神经激活,而抑制PVN内TLR4可以抑制外周交感神经的过度激活。4.抑制PVN内的TLR4可以改善心功能。血流动力学检测结果显示,EF%、LVESP、dp/dtmax、dp/dtmin、SBP、DBP 和 MAP在MI后均下降,抑制PVN内TLR4后则升高;LVEDP在MI后升高,抑制PVN内TLR4后则下降,表明抑制TLR4能够在一定程度上改善MI大鼠的心功能。5.抑制PVN内的TLR4可降低VAs易感性。程序性电刺激实验结果显示,MI后大鼠心律失常评分升高,交感神经过度激活;而抑制PVN内的TLR4则可以抑制交感神经过度激活,在一定程度上降低VAs易感性。研究结论通过本研究,我们证实了 PVN内TLR4/MyD88/NF-kB信号通路能够通过过度激活交感神经系统介导MI后VAs的发生。研究背景心肌梗死（MI）患者因发生室性心动过速（VT）或心室颤动（VF）导致心源性猝死（SCD）占MI患者死因的25%-50%。MI后室性心律失常（VAs）的发生机制主要包括交感神经重构,去甲肾上腺素（NE）大量释放,心肌细胞电重构及组织重构。室旁核（PVN）与中枢交感神经活性增强有关,是控制心血管活动的重要整合部位。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）固有的免疫效应细胞,在损伤或疾病条件下通过内源性免疫反应发挥神经保护或神经毒性的作用。通过第一部分的研究,我们证实了 PVN内toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子kB（NF-kB）信号通路能够通过过度激活交感神经介导MI后VAs的发生。长非编码RNA牛磺酸上调基因1（TUG1）不仅被证明参与心血管疾病,而且在大鼠脊髓缺血再灌注（1/R）模型中,其下调可通过抑制TLR4信号通路对周围神经产生保护作用。研究目的我们旨在通过抑制TUG1评价MI大鼠PVN内促炎细胞因子（PICs）[肿瘤坏死因子a（TNF-a）、白细胞介素1b（IL-1b）和IL-6)]水平,血清和心肌组织去甲肾上腺素（NE）水平,心功能及VAs易感性等指标,探究MI后PVN内TUG1是否能够激活TLR4/NF-kB信号通路促进PICs分泌从而介导MI后交感神经过度激活,导致恶性VAs发生。研究方法（1）MI大鼠模型的建立大鼠被随机分配到5组:1d、3d、5d、7d和sham组（n=8）。在MI后1,3,5,7天,处死大鼠,收集PVN进行实时PCR（RT-PCR）实验检测TUG1的表达水平,western blot实验检测TLR4的蛋白表达水平。（2）PVN微注射腺相关病毒（AAV-shTUG1）设计AAV-shTUG1和其阴性对照病毒AAV-shCtrl,滴度为1.1×1013VG/ml,每侧的注射剂量为0.8ul。AAV-shTUG1和AAV-shCtrl微注射3周后,对大鼠进行假（sham）手术和MI造模手术。大鼠被随机分为4组:sham+shCtrl组（n=44）,sham+shTUG1组（n=43）,MI+shCtrl组（n=46）,MI+shTUG1组（n=50）。大鼠心脏手术后立即进行小动物遥测实验,不间断记录大鼠心电图。3天后进行大鼠心脏超声实验,随后进行肾交感神经活性（RSNA）测定实验,稳定后记录20分钟。大鼠气管插管后,行体内程序性电刺激实验,结束后处死大鼠,回收遥测装置,收集组织。血清和左心室梗死灶灶周3mm内的心肌组织用于酶联免疫吸附（Elisa）实验检测NE水平。PVN用于RT-PCR实验检测TUG1的表达水平,western blot实验检测TLR4、NF-kB、IkB-a的蛋白表达水平,MSD电化学发光实验检测PICs（TNF-a,IL-1b,IL-6）水平。全脑冰冻组织用于双重免疫荧光实验检测TLR4、离子钙接头分子蛋白1（Iba-1）的表达与定位情况。全脑石蜡组织用于免疫组化实验检测的c-fos蛋白表达水平。（3）PVN微注射脂多糖（LPS）及TLR4抑制剂（TAK-242）大鼠被随机分为4组:sham组（n=16）,生理盐水（sterile saline）组（n=16）,LPS组（n=18）,LPS+TAK-242组（n=20）。各组注射量为1ul。sham组用1ul人工脑脊液（aCSF）作为对照组处理。LPS浓度为0.5μg/50nl,TAK-242为0.05mg/kg。24小时后,处死大鼠,收集PVN进行RT-PCR实验检测TUG1的表达水平,western blot实验检测TLR4、NF-kB、IkB-a的蛋白表达量。研究结果1.TUG1 与 TLR4 相关。RT-PCR结果显示,PVN内的TUG1在MI后显著增加,且在第3天达高峰;western blot结果显示,PVN内的TLR4在MI后显著增加,且在第3天达高峰,呈现出与TUG1表达类似的趋势,抑制TLR4能够抑制TUG1和NF-kB水平,即TUG1与TUG1/NF-kB信号通路相关。2.抑制PVN内的TUG1能够抑制TLR4/NF-kB信号通路。RT-PCR结果显示,AAV-shTUG1能够明显抑制TUG1的表达。Western blot结果显示,MI后TLR4水平增加,IkB-a水平下降,NF-kB以NF-kB抑制蛋白a（IkB-a）依赖性的方式发生核转位,而抑制TUG1则可抑制TLR4增加及NF-kB核转位。3.抑制PVN内的TUG1能够抑制PICs产生,改善心功能。MSD实验结果显示,MI后PVN中PICs（TNF-a、IL-1b和IL-6）水平均升高;抑制TUG1可以抑制PICs水平。超声心动图结果显示,MI后大鼠左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）下降,心功能明显降低;抑制TUG1可以改善心功能。4.抑制PVN内的TUG1降低MI后交感神经张力。免疫组化结果显示,MI后PVN内c-fos的水平增加,提示MI后PVN内存在神经元广泛激活;而抑制TUG1能够减少c-fos的水平,说明抑制TUG1能够降低中枢交感神经张力。HRV分析、RSNA检测、Elisa实验结果显示,LF/HF比值和RSNA水平及血清和心肌的NE水平在MI后增加,抑制TUG1后降低,表明MI后大鼠外周交感神经张力增加;而抑制TUG1能够降低大鼠外周交感神经张力。5.抑制PVN内的TUG1能够降低MI后VAs易感性。程序性电刺激实验结果显示,MI后心律失常评分升高,而抑制TUG1则可以抑制交感神经过度激活,即抑制TUG1可在一定程度上降低VAs易感性。研究结论通过本研究,我们证实MI后PVN内交感神经被过度激活,而靶向抑制PVN内TUG1能够通过TLR4/NF-kB信号通路降低交感神经活性,从而降低VAs的发生率。