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本课题将以RO-Heparin为基础，进一步探究肝素乙二醇断裂程度和分子量对肿瘤转移活性的影响及其分子作用机制，旨在阐明乙二醇断裂肝素衍生物抗肿瘤生长转移活性的构效关系。实验通过控制肝素IdoA2S不同程度2-O-脱硫酸、高碘酸氧化/硼氢化钠还原，得到三种不同乙二醇断裂程度(glycol split，Gs)的肝素衍生物，分别记为HP-sp(Gs，25％)，HP-30min-sp(Gs，54％)和HP-60min-sp(Gs，75％);大分子量的乙二醇断裂衍生物仅进行乙二醇断裂，中分子和小分子肝素乙二醇断裂衍生物系经亚硝酸降解、Sephadex G-10分离获得，分别记为B-HP-sp、M-HP-sp、S-HP-sp、B-HP-30min-sp、M-HP-30min-sp、S-HP-30min-sp、B-HP-60min-sp、M-HP-60min-sp和S-HP-60min-sp;还以达肝素(5500-6500Da)为原料，经高碘酸氧化、硼氢化钠还原得到乙二醇断裂程度为25％左右的衍生物，记为M402。 本研究取得的结果及结论有以下几个方面: 1.肝素衍生物的制备 通过控制IdoA2S碱性脱硫酸的反应时间，得到不同程度脱硫酸的肝素衍生物，进一步高碘酸氧化还原后获得不同乙二醇断裂程度的肝素衍生物，建立了乙二醇断裂肝素衍生物的系统性制备方法。Gs分别为25.16％、54.26％和74.97％，记为HP-sp，HP-30min-sp和HP-60min-sp，收率分别为80.4％、59.5％和69％。 为获得不同分子量的乙二醇断裂肝素衍生物，采取亚硝酸降解(pH2.8和pH2.0)、SephadexG-10柱截取获得不同分子量组分。选择进行后续评价的衍生物如下:HP(Mw,16460Da), M402(Mw,5045Da), B-HP-sp(Mw,13736Da),M-HP-sp(Mw,5682Da), S-HP-sp(Mw,4124Da), B-HP-30-sp(Mw,11510Da),M-HP-30-sp(Mw,5694Da),S-HP-30-sp(Mw,3998Da),B-HP-60-sp(Mw,10802Da),M-HP-60-sp(Mw,4396Da),S-HP-60-sp(Mw,3828Da)。 2.肝素衍生物的结构分析 采用1H-NMR和13C-NMR进行肝素衍生物结构的确证。M402、HP-sp、HP-30min-sp和HP-60min-sp在δ3.40左右GlcA的H2，H3信号消失证明非硫酸化糖醛酸C2-C3键断裂;运用13C-NMR定量计算乙二醇断裂程度，M402、HP-sp、HP-30min-sp和HP-60min-sp的Gs分别为24.84％、25.16％、54.26％和74.97％。 应用多角度激光散射法(MALLS)测定肝素衍生物的分子量。测定结果如下:HP(Mw,14320Da),M402(Mw,5163Da),B-HP-sp(Mw,13830Da),M-HP-sp(Mw,6165Da), S-HP-sp(Mw,4406Da), B-HP-30-sp(Mw,11150Da),M-HP-30-sp(Mw,5743Da),S-HP-30-sp(Mw,4006Da),B-HP-60-sp(Mw,8690Da), M-HP-60-sp(Mw,4179Da), S-HP-60-sp(Mw,3673Da)。与GPC-HPLC测量结果相比，HP、HP-30-sp和HP-60-sp分子量偏低，其他结果相近。 通过对肝素衍生物200-800nm紫外扫描，证明对肝素的化学修饰未引进其他的共轭发色团。采用SAX-HPLC对肝素衍生物进行寡糖结构和双糖组成分析，其中非硫酸化双糖结构ⅣS，ⅡA，ⅣA含量为零，硫酸化双糖结构ⅠS，ⅠA，ⅢS含量为HP-sp＞HP-30min-sp＞HP-60min-sp。寡糖结构分析表明，肝素的化学修饰未破坏肝素的母体结构。 3.肝素衍生物的体外抗肿瘤活性和抗凝活性的研究 3.1肝素衍生物对肿瘤细胞增殖的影响 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测了肝素衍生物对肿瘤细胞SKOV-3、HT-29和B16-F10体外增殖的影响。各肝素衍生物有效抑制SKOV-3和B16-F10细胞增殖，而对HT-29的影响较小。各肝素衍生物对肿瘤细胞的增殖未表现出明确的构效关系，实验发现B-HP-60-sp在500μg/mL时对三种细胞均有较强的抑制率(p＜0.05)，值得进一步体内和体外研究。 3.2肝素衍生物拮抗P-Fc与HL-60细胞结合 运用流式细胞术考察了肝素衍生物对重组P-选择素/Fc嵌合蛋白(P-Fc)与HL-60细胞结合的影响。5 mg/mL浓度时，M402、HP、B-HP-sp、B-HP-30-sp、B-HP-60-sp和M-HP-60-sp表现出了显著的抑制活性，抑制率分别为68.08％、81.22％、79.27％、70.32％、76.13％和79.12％。 3.3肝素衍生物抑制HPA活性 此外，体外检测了肝素衍生物对HPA活性的影响。10μg/mL浓度时，肝素衍生物除B-HP-60-sp、M-HP-60-sp和S-HP-60-sp外均能显著抑制HPA对HS的降解。相同乙二醇断裂程度不同分子量的衍生物中，HPA抑制活性差异不显著。HP的抑制活性最强，明显强于M402(p＜0.05)。 3.4肝素衍生物抑制肿瘤细胞的体外侵袭 采用Transwell侵袭实验研究肝素衍生物对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响。与空白对照相比，各肝素衍生物在200μg/(9×104)cells时均可以抑制SKOV-3细胞的体外侵袭(P＜0.05)。结果表明，随着乙二醇断裂程度增大，肝素衍生物抑制肿瘤细胞体外侵袭能力减弱，而分子量的影响则相对较小。 3.5肝素衍生物的体外抗凝活性 采用激活部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)法测定各肝素衍生物的抗凝活性。各肝素衍生物与UFH相比抗凝活性明显降低，且乙二醇断裂程度越高、分子量越小，肝素衍生物的抗凝活性越低。 4.肝素衍生物体内抗肿瘤转移活性的评价 利用小鼠黑色素瘤肺部转移模型，考察了6种肝素衍生物的体内抗肿瘤转移情况。与模型给N.S.组相比，各肝素衍生物在15 mg/kg·d剂量下均能明显抑制小鼠肺部转移结节数(P＜0.05)，同时发现肝素衍生物有抑制肿瘤细胞肝肠转移的作用。结果表明，肝素衍生物乙二醇断裂程度越大、分子量越小，抗肿瘤转移活性越小，以HP和B-HP-SP抗肿瘤转移活性最优。 免疫组化结果发现，HP组中HPA、P-selectin和CD31表达明显减弱，M402和B-HP-sp组中HPA、P-selectin表达明显减弱，而B-HP-30-sp和M-HP-60-sp仅P-selectin的表达明显减弱。结果表明，肝素衍生物对HPA、P-selectin和CD31表达的抑制与其抑制肺部转移活性相关。 HE染色结果发现，HP组髓窦扩张、充血，脾脏体积和重量明显增大。关于引起脾重增加的原因以及肝素的抗肿瘤活性与其所引起的脾脏肿大现象是否存在一定联系，均有待于进一步研究。B-HP-sp在众多肝素衍生物中表现出明显优势，而且抗凝活性很弱，可作为抗肿瘤转移的候选化合物。 5.课题总结及创新 (1)本课题建立了制备不同乙二醇断裂程度肝素衍生物的方法，在最小程度地破坏肝素糖链分子完整性的前提下，显著降低了其抗凝活性，解决了肝素用于肿瘤治疗存在出血危险的难题。 (2)对制备获得的各肝素衍生物进行结构分析及抗凝活性的测定，表明乙二醇断裂和糖链断裂均显著影响肝素的抗凝活性，随着乙二醇断裂程度增大和分子量降低，抗凝活性随之降低。 (3)对各肝素衍生物进行体外抗肿瘤活性的评价，以HP和M402为对照。MTT和P-选择素活性抑制实验中，各肝素衍生物未表现出明显的构效关系;HPA抑制实验中，肝素衍生物能够抑制HPA的活性，且发现乙二醇断裂程度越大、分子量越小，对HPA的抑制活性越小;Transwell侵袭实验进一步确证了肝素衍生物抗肿瘤转移机制，且乙二醇断裂程度是影响肿瘤细胞侵袭转移的重要因素，而分子量对其影响相对较小。 (4)体内评价结果中，HP、B-HP-sp和M402在体内评价中表现出良好的抗肿瘤转移活性;免疫组化检测表明，肝素衍生物对HPA、P-selectin和CD31表达的抑制与其抑制肺部转移活性相关。 (5) HE染色发现，HP组脾脏体积明显增大，其作用有待进一步评价。 本课题以乙二醇断裂肝素衍生物为基础，制备了不同乙二醇断裂程度和分子量的肝素衍生物，较为系统地考察了其抗肿瘤转移活性和机制。结果表明，以B-HP-sp为代表的乙二醇断裂肝素衍生物，作用于肿瘤转移过程的重要靶点，如P-选择素和HPA，并能够体外抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，在黑色素瘤肺转移模型中体现出显著的抗肿瘤转移活性。本研究初步发现，肝素中乙二醇断裂程度越小、分子量越大，其抗肿瘤转移活性越强。鉴于HP抗肿瘤的毒副作用，B-HP-sp以其低抗凝活性、高抗癌活性的优势有望发展成为新一代抗肿瘤多糖药物。