论文部分内容阅读
L-乳酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、医药、农业和化工中,利用L-乳酸制备的聚L-乳酸是一种新型的可生物降解材料。细菌发酵和真菌发酵是发酵生产L-乳酸的主要方法,其中米根霉具有营养要求简单、可进行同步糖化发酵、产酸光学纯度高等优点,是工业化生产最有潜力的菌株之一。但是,目前米根霉发酵生产L-乳酸仍然存在发酵强度低、原料利用率不高、菌体形态难以控制等问题。本文以米根霉AS3.819为生产菌株,以提高L-乳酸产率及发酵强度为主要目标,研究米根霉半连续高强度发酵产L-乳酸的关键技术。通过优化摇瓶发酵条件,进行米根霉菌丝球半连续发酵生产L-乳酸和罐发酵试验,建立其动力学模型,分析发酵中菌丝球的生长过程,并采用计算流体动力学（CFD）模拟技术对其发酵条件进行模拟优化。主要研究结论如下:（1）通过对种子培养条件及半连续发酵条件的优化,获得摇瓶中米根霉菌丝球半连续高强度发酵生产L-乳酸的控制模式:首批发酵中250 mL三角瓶装50 mL培养基,接种量10%,种子液32℃培养24 h,摇床转速200 r/min,发酵前期（0～36 h）温度为28～30℃,发酵后期（36～72 h）温度为32～34℃;重复批次发酵中每批发酵24 h。该发酵条件下,半连续稳定发酵30批,首批发酵菌丝球直径稳定控制为0.8～1.0 mm,其产酸能力较高,发酵强度为1.58g/（L·h）,重复批次发酵强度2.67～3.00 g/（L·h）。（2）研究3L发酵罐中发酵温度、搅拌转速及通气量对米根霉首批发酵产L-乳酸的影响,建立了米根霉菌丝球高强度发酵产L-乳酸的控制模式:发酵0～30h温度32～34℃、搅拌转速400 r/min、通气量1.5 L/（L·min）,30～60 h温度34～36℃、搅拌转速300 r/min、通气量0.5 L/（L·min）;该条件下,菌丝球直径稳定控制为0.9～1.2 mm,其产酸能力较高,发酵强度为2.51g/（L·h）。对重复批次发酵中葡萄糖质量浓度、温度、搅拌转速及通气量对发酵强度的影响进行研究,得到3L发酵罐中重复批次发酵生产L-乳酸的控制模式:补料培养基中葡萄糖质量浓度100 g/L,温度34～36℃、搅拌转速300 r/min、通气量0.5 L/（L·min）,半连续发酵5批,每批发酵周期为20 h,发酵强度大于3.80g/（L·h）。（3）补料培养基中N源及无机盐质量浓度对半连续发酵过程影响的研究表明,N源和无机盐是半连续发酵稳定进行不可缺少的因素:生物量在一定范围内增加,不能提高其发酵强度,在半连续发酵中间歇取出部分菌体保持DCW为10 g/L左右,可以维持高强度发酵。采用以上优化发酵条件,7 L发酵罐中米根霉半连续发酵生产L-乳酸25批,首批发酵强度为2.47 g/（L·h）,第2～20批发酵强度3.40～3.85 g/（L·h）,实现了米根霉半连续高强度稳定发酵生产L-乳酸。（4）对米根霉半连续发酵产L-乳酸菌体生长、产物生成及底物消耗的动力学进行研究,发现重复批次发酵中每批产物生成及底物消耗曲线接近于直线。选择Logistic及Luedeking-Piret方程作为米根霉发酵产L-乳酸的动力学方程,运用Matlab软件将试验数据进行拟合,对方程中关键参数求解,建立米根霉半连续发酵动力学模型,并对模型进行验证。其中首批发酵动力学模型中Xm为7.6164 g/L、μm为0.1802 h-1、α为3.2631、β为0.5980、p为1.9875、q为1.0232;重复批次发酵过程中,对初始菌体量及L-乳酸产量采用“零处理”方法,进行动力学方程求解,其中第2批发酵动力学模型中Xm为8.246 g/L、μm为0.0087h-1、α为0.9610、β为0.4929、p为3.2438、q为1.0326,δ为98.63%;半连续发酵第2批到第10批,每批的生物量逐渐增加,菌体最大比生长速率逐渐减小,菌体重复利用效率逐渐降低但仍大于90%,最大比产物合成速率逐渐减小。验证试验表明建立的动力学模型能够很好的描述发酵过程（R2≥0.98）。（5）对摇瓶及发酵罐中菌体生长过程进行分析,菌丝球的形成过程为:孢子萌发成菌丝,菌丝凝聚在一起形成菌丝元,菌丝元生成具有致密菌核的菌丝球;发酵后期菌丝球内部逐渐形成中空核,且该中空核及菌丝球直径越来越大;重复利用多次的菌丝球逐渐破裂成菌片,菌片表面菌丝生长,大部分形成具有菌毛层的菌片,极少部分形成游离菌丝;菌片中心菌丝自溶衰亡形成具有中空核的菌囊;随着发酵的进行,菌囊由于其内部菌丝衰亡及流体剪切作用破碎成菌片。半连续发酵液中规则菌丝球、菌片、菌囊3种不同形态的菌丝球相互转变,其中规则菌丝球百分比逐渐降低,菌片及菌囊百分比逐渐增加;它们都具有较高的L-乳酸脱氢酶（LDH）活性,共同维持了半连续高强度发酵的进行。通过石蜡切片观察发现,具有致密菌核的菌丝球菌体代谢产酸能力较强;具有中空核的菌丝球壁外缘菌体细胞代谢活力旺盛。（6）菌丝球大小对发酵强度影响比较明显,直径过大或过小的菌丝球产酸能力较低,直径为0.9～1.2 mm的菌丝球,产酸能力较高,有利于高强度发酵生产L-乳酸。（7）采用CFD模拟技术对3 L发酵罐内不同转速的流体动力学进行模拟,建立3 L发酵罐中发酵工艺的CFD调控模式:首批发酵中剪切速度范围为0.009～1.582 m/s,重复批次发酵中剪切速度范围为0.009～1.192 m/s;根据该控制模式,优化7 L发酵罐中发酵条件,采用该优化发酵条件米根霉半连续高强度发酵生产L-乳酸20批,其中首批发酵强度为2.51g/（L·h）,重复批次发酵强度为3.58～4.01g/（L·h）;对50 L放大发酵罐的CFD模拟,确定了放大发酵条件,实际50 L放大发酵罐发酵试验中发酵产酸为94.56 g/L。利用米根霉菌丝球半连续高强度发酵生产L-乳酸,增加了菌体利用率,节约了原材料、缩短了重复批次发酵周期、提高了发酵强度,为实现米根霉半连续高强度发酵生产L-乳酸的工业化奠定了良好的基础。