根据公布的产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxin Escherichia coli,ETEC)的不耐热肠毒素B亚单位(heat-labile enterotoxin B subunite,LTB)和K99菌毛抗原的核苷酸序列。设计特异的引物,通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增得到LTB和K99基因。回收纯化后将LTB和K99基因用T4DNA连接酶连于克隆载体pBS-T上,热击法转化受体菌大肠杆菌top10,蓝白斑筛选阳性菌落,酶切鉴定、测序,证明其中含有LTB和K99基因片段,分别命名为pBS-LTB和pBS-K99。在此基础上构建LTB-K99融合基因的重组质粒pBS-LTB-K99。将鉴定结果正确的重组质粒和原核表达载体质粒pET-28a用Bam HI/xhoI分别双酶切,通过T4DNA连接酶将目的基因片段克隆入表达载体中,经菌落PCR、质粒PCR扩增及质粒酶切鉴定,证实融合基因已克隆到表达载体中,且具有正确的读码框和方向性,表明正确构建了LTB-K99融合基因的原核表达载体pET- LTB-K99。利用热击法将重组质粒pET-LTB-K99转化入BL21(DE3)大肠杆菌中,经过IPTG诱导进行蛋白表达,SDS-PAGE、Western-Blot检测所表达的蛋白。结果:扩增的LTB和K99基因在GenBank进行比对表明保守性高。LTB-K99融合基因全长为966bp,推导其氨基酸序列有322个编码氨基酸,分子量大小为33.8KD。经检测表明无核苷酸插入或缺失现象。经SDS-PAGE、Western-Blot检测表明,成功的构建了pET-LTB-K99重组质粒,并在大肠杆菌中实现了表达。结果表明:表达产物较丰富,能和ETEC免疫的兔血清发生特异性结合,和国外研究的结果一致,表达的蛋白具有特异性。