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种公鸡养殖是肉鸡生产的关键环节,种公鸡的繁殖性能会直接影响种蛋的受精率、孵化率和商品代肉鸡生长表现。睾丸作为种公鸡的性腺,其良好的代谢及免疫状况可保证种公鸡具有良好的繁殖性能,从而确保种公鸡在肉鸡生产中的健康高效利用。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是一种高效绿色免疫调节剂,可显著改善动物体的免疫机能,还能调控动物体的代谢过程。本研究在种公鸡日粮中添加APS,研究APS对睾丸miRNA表达的影响,并阐明差异表达miRNA在睾丸代谢及免疫过程中所发挥的作用。试验一APS调控种公鸡睾丸组织mi RNA的差异表达本试验通过small RNA-seq方法筛选种公鸡睾丸中由于饲粮添加APS而引起的差异表达miRNA。选取1日龄科宝500肉鸡父母代种公鸡64只,随机分为空白对照组(Control组)和APS处理组,每个处理4个重复,每个重复8只鸡。对照组饲喂玉米-豆粕型基础饲粮,APS处理组在每千克基础饲粮中额外添加10克APS,种公鸡饲养40周时,对各处理睾丸组织进行高通量测序。结果表明,在种公鸡睾丸中共发现1305种miRNA,584个miRNA共表达于种公鸡睾丸Control组和APS组,有79和76个miRNA分别单独存在于Control组和APS组。miRNA差异表达分析结果表明,种公鸡饲粮添加APS可显著改变种公鸡睾丸miRNA的表达情况,共鉴定出33个差异表达mi RNA,其中16个miRNA上调,17个miRNA下调。随机选取7个差异表达miRNA进行实时定量PCR验证,结果表明测序结果准确性较高,可代表睾丸组织样品真实的miRNA表达状况。试验二APS调控差异表达miRNA的靶基因预测及功能验证本试验在高通量测序筛选差异表达miRNA的基础上,对显著差异表达的mi RNA进行靶基因预测,并结合miRNA靶基因的GO和KEGG信号通路功能富集分析探索APS对睾丸器官功能状态的影响。GO和KEGG信号通路功能富集分析发现,筛选到的差异表达miRNA可调控睾丸的物质代谢过程,包括核苷酸代谢(GO:0009117),蛋白水解的调节(GO:0030162),磷脂的生物合成过程(GO:0008654),丙酸代谢(ko00640),脂肪酸代谢(ko00071),以及包括半胱氨酸和蛋氨酸代谢(ko00270)和烟酸和烟酰胺代谢(ko00760)在内的一碳单位代谢过程等代谢途径(ko01100),这些代谢都与睾丸发育和功能发挥密切相关。与此同时,我们发现APS可影响睾丸组织“自然杀伤细胞介导的细胞毒性作用”这一信号通路。通过miRNA-gene网络图分析发现gga-miR-16在该通路中发挥着重要作用。我们通过实时定量PCR检测该通路中miR-16调控的4个靶基因在睾丸的表达水平,结果显示,相较于Control组,IFNGR2和MAP2K1表达显著降低(P<0.05),MAP2K2表达显著增加(P<0.05)而SH3BP2无明显差异(P>0.05)。我们选择与mi R-16表达作用模式相符的IFNGR2和MAP2K1作为gga-miR-16的潜在靶基因来进行后续的双荧光素酶报告检测,结果表明,相较于Control组及阴性对照组(mimic-NTC组),miR-16-5p mimic转染细胞后p2-IFNGR2和p2-MAP2K1重组质粒的萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性比值显著降低(P<0.05),表明miR-16-5p可有效结合到IFNGR2和MAP2K1 3’UTR区的靶位点。结合双荧光素酶报告检测及靶基因表达量的在体验证结果,表明APS可通过下调miR-16-5p的表达进而上调IFNGR2和MAP2K1基因的表达。综上,本研究表明种公鸡日粮中添加10 g/kg APS可显著影响种公鸡睾丸中mi RNA的表达,其差异表达miRNA可调控睾丸物质代谢及免疫调控过程,且可通过下调miR-16-5p的表达进而上调IFNGR2和MAP2K1的表达。