缺氧是许多疾病所共有的一个基本病理过程。是临床医学、高原医学、航空航天医学等研究的核心问题。研究缺氧发生和发展的规律以及缺氧习服机制，对于保障高原建设者和世居高原人群的健康、边疆地区的经济发展、巩固国防以及拓宽人类生存空间具有重要的现实意义。脑是机体内各系统缺氧反应的主宰者，只有在脑组织功能正常的情况下，才有可能通过呼吸、循环、血液等系统建立起一整套适应缺氧环境的代偿机制，因此，缺氧中枢神经系统功能障碍及习服的分子机制是高原医学研究的首要问题之一。基因差异表达是调控细胞生命活动的核心机制，是生物体完成基本生命活动以及对外界刺激作出应答的分子基础。阐明基因选择性表达所依赖的调控信息及其相互作用的分子机制，已经成为功能基因组学领域内基因表达调控研究国际竞争的焦点。对低氧应激反应相关基因表达及调控信息的认识成为研究缺氧中枢神经系统功能障碍及习服的核心内容之一。 人类基因组系统分析的结果告诉我们，在序列占有量还不到整个基因组2％的蛋白质组中，调节基因表达的转录因子占据了相当大的比例，约3000左右。这些转录因子在调控基因表达时相互作用，形成了极为复杂的基因表达调控网络。从研究单一的调控环节拓展到深入探讨它们之间的相互联系及其控制过程，从调控网络的角度探寻低氧适应基因及其诱导的调控机制，不仅有助于更深入认识低氧适应的分子机制，而且可为有效预防高原低氧损伤医学措施的制定提供更直接的科学依据。 近十年的研究证实，在基因表达调控网络中，除了转录因子这一活跃的因素以外，转录辅激活子因其多转录因子结合功能，而成为网络中活跃的因素之一。转录辅激活子表达变化及其结合蛋白谱的改变成为联系外界信号和基因表达的中心环节。转录辅激活子p300在缺氧基因表达调控中起重要作用，已发现多种缺氧相关转录因子活性的发挥依赖p300，p300的蛋白结合功能受外界环境、细胞环境的精密调控。我们推测p300蛋白表达量、蛋白结合功能是影响缺氧相关基因的选择性表达的重要方面。而相关的研究尚未见报导。 本研究以大鼠海马组织及NPC12细胞为研究对象，探讨p300表达及其结合功能在缺氧神经细胞损伤中的作用。课题分为四个部分：一、比较大鼠p300蛋白表达的细胞、组织和性别差异性；二、利用低压舱模拟高原5000m低氧环境，从整体动物水平，阐明缺氧对p300基因表达及其结合功能的影响；三、以NPC12细胞为对象，利用CoCl2处理构建缺氧细胞模型，从细胞水平阐明p300表达变化及其结合功能改变对CoCl2处理细胞损伤的影响；四、利用RNAi技术抑制NPC12细胞中p300的表达，进一步阐明p300表达变化及其结合功能改变对CoCl2处理细胞损伤的影响，并比较了p300表达抑制后，NPC12细胞对CoCl2处理以及低氧培养耐受性变化的差异。 本课题的研究结果如下： 一、大鼠组织中p300蛋白表达及分布特点。运用免疫组织化学技术和免疫印迹技术，对大鼠不同组织中p300蛋白的表达和分布进行检测，探讨p300在组织蛋白差异表达中的作用。结果显示，p300蛋白在心肌、肝脏、肺脏、肾脏、睾丸、小脑、海马、大脑皮质中均有分布，定位于核内。睾丸组织里p300主要分布在生精小管外层的精原细胞中，在成熟精子细胞未检测到阳性表达；肾脏中p300主要分布在髓质上皮细胞；海马p300主要分布在锥形神经元层；大脑皮质中p300主要分布在皮质神经元，在分子层中表达弱阳性；小脑蒲肯野细胞中p300表达强阳性。肝脏的肝细胞中p300均匀分布，肺脏中p300表达较弱。雌性大鼠p300蛋白在心肌、比目鱼肌表达水平高，其次是肾脏、肝脏，在下丘脑中未检测到明显的阳性表达；雄性大鼠p300蛋白在心肌、比目鱼肌表达水平高，其次是小脑、肝脏和睾丸，在下丘脑中未检测到明显的阳性表达；雌性大鼠心肌和肾脏组织中p300蛋白水平高于雄性大鼠。结论：p300是普遍表达的核蛋白，其分布和表达水平有细胞、组织和性别差异性，p300可能在细胞、组织对外界刺激的反应性差异中起作用。 二、缺氧对p300蛋白表达、分布及其结合功能的影响。利用RT-PCR、Westernblot、免疫共沉淀、斑点杂交技术分析模拟海拔5000m连续缺氧过程中大海马组织p300表达和结合功能的改变，探讨p300在缺氧神经细胞损伤-习服机制中的作用。结果显示：①缺氧过程中大鼠海马组织锥形神经元细胞形态学改变：与平原对照组相比，缺氧1天组海马组织中未见明显改变，缺氧5天、15天和30天时，部分神经元体积变小，染色质聚集深染，部分神经元核呈梭形或三角形，固缩深染。②缺氧对大鼠海马组织中p300分布的影响：缺氧过程中，p300阳性细胞仍然集中在锥形神经元层。③缺氧对大鼠海马组织中p300mRNA表达的影响：缺氧1天后，p300转录水平增加，在缺氧五天时达到高峰，缺氧15天时下降，缺氧30天时较缺氧15天略有上升，但没有显著差异。缺氧各组p300mRNA量与平原对照组相比，差异具有显著意义。④缺氧对大鼠海马组织中p300蛋白表达的影响：缺氧1天后，p300蛋白水平增加，缺氧各组间的p300蛋白量差异无显著意义。缺氧各组与平原对照组的差异有显著意义。⑤缺氧对大鼠海马组织p300与HIF-1α、p65结合率的影响：p300与HIF-1α结合在缺氧1天时最高，随后下降；p300与p65结合在平原对照组中最高，在缺氧1天后下降，在缺氧15天时，略有回升，但仍低于平原对照组。⑥缺氧过程中大鼠海马组织p300结合蛋白谱变化：通过一维电泳的分离结果显示，各组间蛋白结合的种类有明显差异。结论：模拟海拔5000m缺氧不仅上调大鼠海马组织中p300的转录和蛋白水平，而且影响p300的蛋白结合功能，提示p300在缺氧海马的病理生理活动中起作用，蛋白表达增加以及结合蛋白功能的改变p300发挥作用的两种方式。 三、CoCl2处理对NPC12p300蛋白的表达和结合功能的影响。以NPC12细胞为细胞模型，利用Westernblot、免疫共沉淀、斑点杂交技术观察CoCl2处理对p300表达和结合功能的影响及其与NPC12细胞损伤的关系。1、CoCl2(200μmol/L)处理过程中NPC12细胞形态学变化：对同一视野下细胞的形态观察结果显示，处理后3h，细胞突起增多，胞体变小，随着处理时间的延长，突起缩短，胞体皱缩，光晕逐渐消失，到48h时大部分细胞裂解、死亡。2、CoCl2(200μmol/L)处理过程中NPC12细胞活力的变化：①LDH释放率的变化：未处理NPC12细胞，在培养6h时，LDH释放率下降，与3h时相比差异具有显著意义，在12h以后，LDH释放率增加；处理NPC12细胞，LDH释放率变化呈同样的变化规律，但处理12h以后，处理组LDH释放率显著高于相应时间点未处理组。②细胞存活率的变化：200μmol/L处理细胞组存活率在24h时显著高于未处理组细胞，随后下降。500μmol/L处理细胞组存活率显著下降，低于相应时间点200μmol/L处理细胞组和未处理组细胞。③MTT法检测NPC12细胞活力变化：200μmol/L处理细胞组活力在12h显著低于非处理组细胞，500μmol/L处理细胞组活力显著低于相应时间点200μmol/L处理细胞组和未处理细胞。3、CoCl2处理对NPC12细胞p300表达和分布的影响：p300蛋白水平在CoCl2处理后6h明显增加，并持续高表达至24h，随后下降，但仍高于处理前。p300表达定位于细胞核内的非核仁区。4、CoCl2处理NPC12细胞p65的表达和分布的影响：p65蛋白水平在CoCl2处理后3h增加，在6h达到高峰，随后下降。处理前p65蛋白主要分布在细胞胞浆，在处理后6h，p65向核内转移，并在随后处理至24h内在核内和胞浆中均有分布，在处理48h时，部分细胞中核内p65的分布降低。5、CoCl2(200μmol/L)处理过程中NPC12细胞p300与HIF-1α、p65结合率的变化：CoCl2处理过程中，p300与HIF-1的结合在3h时最高，随后下降，而p300与p65的结合在CoCl2处理过程中下降，在48h时增加。 结论：CoCl2处理上调NPC12p300蛋白表达，影响p300的蛋白结合功能，但p300-p65结合不受p300和p65蛋白水平变化的影响，可能与其它机制有关。p300表达和结合功能的时空变化趋势与NPC12细胞活力的改变一致，提示p300可能是影响NPC12细胞CoCl2耐受性的重要因素。 四、干扰p300表达后NPC12细胞对CoC12、低氧培养耐受性的影响。通过RNA干扰抑制p300蛋白表达，观察NPC12细胞对CoCl2、低氧培养的耐受性改变，探讨p300在不同的缺氧模式中的作用差异。 综上所述，缺氧能上调p300蛋白表达，影响其蛋白结合功能，但p300对CoCl2和低氧处理条件下神经细胞耐受性的影响不同：抑制p300表达，NPC12对CoCl2处理的耐受性增加，但增加了NPC12对低氧处理的敏感性，提示p300蛋白表达的增加可能是海马组织对缺氧刺激的一种适应性改变；p300表达和蛋白结合功能的改变在缺氧神经细胞损伤-习服机制中发挥重要作用，但其作用方式与缺氧的环节有关。本研究为设计缺氧神经细胞保护措施，抑制神经细胞变性提供了新的线索。