目的:巴豆酰化作为新型蛋白翻译后修饰（PTM）,广泛存在于真核细胞中,并在进化上保守。巴豆酰化可以被巴豆酰转移酶和脱巴豆酰化酶可逆地调节。蛋白质组学分析表明,许多调控生理功能、参与疾病发病机制的关键细胞蛋白都可以被巴豆酰化修饰。然而,巴豆酰化在结直肠癌（CRC）发病机制中的作用仍不明确。PRKACA是蛋白激酶A（PKA）的主要催化亚基,其突变会导致肾上腺皮质肿瘤。ENO1（α烯醇化酶）作为糖酵解途径的关键酶,在CRC中的过表达是一种致癌因素。本课题拟研究PRKACA及ENO1的巴豆酰化与CRC之间的联系,探讨其对CRC生物学功能的影响及下游通路,以明确CRC发病过程中的关键环节,为CRC的诊断和治疗提供潜在靶点。方法:我们首先用免疫印迹法检测了CRC及癌旁正常组织中的整体巴豆酰化水平,并用4D-LFQ全蛋白组学联合巴豆酰化修饰组学对巴豆酰化蛋白及位点做了定量鉴定及生物信息学分析。然后,利用免疫沉淀法筛选出PRKACA及ENO1的巴豆酰转移酶和脱巴豆酰化酶。随后,用免疫印迹法、免疫组化方法检测SIRT3在CRC组织中的表达,并用CCK8法、集落形成实验、Transwell法、细胞划痕实验检测SIRT3对HCT116增殖、侵袭和迁移能力的影响。接下来,用Tims TOF Pro MS/MS谱图鉴定PRKACA和ENO1的主要巴豆酰化位点。构建PRKACA-K84Q、PRKACA-K84R、ENO1-K420Q或ENO1-K420R质粒转染CRC细胞,对其进行以下研究:检测PRKACA-K84Q、K84R、ENO1-K420Q、420R分别对CRC细胞生长、侵袭、迁移、PKA酶活性和ENO1活性的影响;构建PKA的晶体结构和免疫沉淀方法探讨PRKACA K84与调节亚基的相互作用;检测ENO1 K420Q、K420R细胞内外乳酸含量和无糖培养条件下细胞的存活率。同时,将si PRKACA+K84Q/WT和si ENO1+K420Q/WT HCT116细胞分别进行转录组测序,分析差异表达基因,并用荧光定量PCR和免疫印迹实验验证下游通路。最后,免疫沉淀法分析了CRC与癌旁组织中PRKACA和ENO1巴豆酰化表达水平。结果:CRC巴豆酰化蛋白主要定位在胞浆中,其次是线粒体和细胞核。巴豆酰化的基序特征是多见负电荷氨基酸。代谢过程、细胞连接、酶促反应等多种生物学过程都有巴豆酰化蛋白参与,其中包括PRKACA和ENO1。CBP上调PRKACA和ENO1巴豆酰化水平,SIRT3和SIRT2分别下调PRKACA和ENO1巴豆酰化水平,其中SIRT3在CRC组织中表达显著下降,体外过表达能抑制CRC进展。K84和K420分别是PRKACA和ENO1主要巴豆酰化位点。PRKACA K84Q和ENO1 K420Q提高CRC细胞的增殖、侵袭、迁移能力,而K84R和K420R结果相反。无论有无Forskolin刺激,PRKACA K84Q都提高PKA活性,并磷酸化CREB Ser133,而K84R有相反的结果。PKA晶体结构显示K84位于PRKACA与PRKAR1A交界处。免疫沉淀方法显示PRKACA K84Q与内源及外源性PRKAR1A结合能力下降,且RP-c AMPS不能抑制K84Q升高的PKA活性。PRKACA WT和K84Q之间的差异表达基因集中在与肿瘤相关的通路。PRKACA K84Q磷酸化FAK Y397、Akt S473、Paxillin Y118,并提高CCNE2蛋白水平,这种效应被H89抑制,而K84R作用相反。ENO1 K420Q显著提高了ENO1活性,增加了细胞内外乳酸含量,并降低HCT116细胞在无糖时的凋亡率,ENO1 K420R作用相反。ENO1 K420Q和WT差异表达的基因也富集在肿瘤相关通路,且与PRKACA K84Q影响的基因有交叉。PRKACA和ENO1巴豆酰化在CRC肿瘤组织中增加,但与蛋白表达量、TNM分期及患者临床病理特征均无关。结论:CRC肿瘤组织中巴豆酰化水平上调,参与多种肿瘤相关的功能通路;CBP是PRKACA和ENO1的巴豆酰转移酶;SIRT3和SIRT2分别是其脱巴豆酰化酶;SIRT3在CRC组织中缺乏,是CRC的肿瘤抑制因子。我们的研究揭示了PRKACA-K84巴豆酰化通过降低PRKACA与调节亚基的结合,结构性激活PKA的活性,导致下游FAK/AKT通路磷酸化,进一步上调了Paxillin磷酸化和CCNE2蛋白表达,从而促进了CRC的生长和转移;而ENO1-K420巴豆酰化通过激活ENO1酶活,升高肿瘤细胞内外乳酸的含量,维持了葡萄糖缺乏时癌细胞的活力。PRKACA和ENO1巴豆酰化与CRC的发生发展有关,而与CRC的病程无关,且ENO1-K420巴豆酰化和PRKACA-K84巴豆酰化影响共同的肿瘤相关基因,提示巴豆酰化在CRC中是一种潜在的致瘤因素,为CRC的发病机制研究提供了新的见解。