【摘 要】
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谷氨酸作为一种功能性氨基酸,在维持肠道发育过程中发挥重要作用。为了研究谷氨酸对断奶仔猪肠道发育的影响并探究其作用机制,选取14头28日龄健康、体重相近(7.90±0.50 kg)的三元杂(杜×长×大)断奶阉公猪,随机分为对照组和谷氨酸组,每组7个重复,每个重复1头猪。对照组饲喂玉米-豆粕基础日粮,添加1.00%玉米淀粉,谷氨酸组饲喂玉米-豆粕基础日粮添加1.00%谷氨酸。预饲期7天(玉米-豆粕基础
【基金项目】
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广州市科技计划项目(201807010001); 国家自然科学基金面上项目(31872389);
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谷氨酸作为一种功能性氨基酸,在维持肠道发育过程中发挥重要作用。为了研究谷氨酸对断奶仔猪肠道发育的影响并探究其作用机制,选取14头28日龄健康、体重相近(7.90±0.50 kg)的三元杂(杜×长×大)断奶阉公猪,随机分为对照组和谷氨酸组,每组7个重复,每个重复1头猪。对照组饲喂玉米-豆粕基础日粮,添加1.00%玉米淀粉,谷氨酸组饲喂玉米-豆粕基础日粮添加1.00%谷氨酸。预饲期7天(玉米-豆粕基础日粮),正试期21天。分离血清检测血清氨基酸含量,采集各肠段样品,经4%多聚甲醛和2.5%戊二醛分别固定,通过HE染色和免疫组化等技术检测肠道形态结构和功能相关指标;饲养试验第19天,收集饲料样品及粪便样品,粪便样品加入稀盐酸混匀后保存于-20℃。经Ti O2指示剂法评定谷氨酸对断奶仔猪营养物质表观消化率的影响。收取两组仔猪空肠组织蛋白质样品,同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ)分析其差异蛋白质表达及信号通路富集情况。同时分离各组猪的空肠隐窝进行体外三维立体培养,观察类肠团生长情况并统计肠道干细胞扩增为类肠团的生成效率和出芽指数。此外,离体水平上通过添加谷氨酸处理猪空肠上皮细胞系(Intestinal porcine enterocyte cell line,IPEC-J2)及仔猪空肠干细胞,探究谷氨酸对IPEC-J2细胞增殖和肠道干细胞活性以及Wnt/β-catenin信号通路的影响。试验结果如下:(1)与对照组相比,日粮添加谷氨酸可使断奶仔猪平均日增重数值上增加6.6 g(P>0.10),对耗料增重比无影响(P>0.10),具有增加平均日采食量的趋势(P=0.062)。(2)与对照组相比,日粮添加谷氨酸致血清中谷氨酸含量显著增加21.36%(P<0.05),甘氨酸含量显著增加38.72%(P<0.05),鸟氨酸增加幅度最大,为57.20%(P<0.05)。血清脯氨酸含量有增加的趋势(P=0.072)。(3)与对照组相比,日粮添加谷氨酸可使日粮粗脂肪表观消化率显著提高11.58%(P<0.05),干物质表观消化率显著提高5.61%(P<0.05),粗蛋白质表观消化率显著提高5.43%(P<0.05)。(4)与对照组相比,日粮添加谷氨酸显著提高断奶仔猪单位长度空肠和回肠重量及其黏膜重量(P<0.05),空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度也显著增加(P<0.05);谷氨酸组空肠上皮细胞增殖标志增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、分化标志重组角蛋白质(Keratin 20,KRT20)、各功能细胞标志Villin(绒毛蛋白质,吸收细胞标志)、Chg A(嗜铬粒蛋白质A,肠内分泌细胞标志)、Mucin2(黏蛋白质,杯状细胞标志)及肠道干细胞标志富含亮氨酸重复序列G蛋白耦联受体5(Leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5,Lgr5)和B细胞特异性莫洛尼小鼠白血病病毒结合位点1(B cell specific moloney murine leukemia virus insertion site 1,Bmi1)表达量均显著上调(P<0.05)。(5)iTRAQ蛋白质组学结果表明,与对照组相比,日粮添加谷氨酸显著上调Wnt/β-catenin信号通路,Western blotting进一步证实日粮添加谷氨酸显著上调断奶仔猪空肠组织β-catenin、T细胞因子4(T cell factor 4,TCF4)、c-Myc、Cyclin D1等蛋白质表达水平(P<0.05)。(6)细胞计数的结果显示,谷氨酸处理IPEC-J2细胞24 h后,其增殖能力显著高于对照组(P<0.05),增殖标志Ki67阳性细胞数目显著增加(P<0.05);Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白质β-catenin、TCF4、c-Myc、Cyclin D1的表达量显著上调(P<0.05)。(7)与对照组相比,日粮添加谷氨酸可显著增加干细胞扩增为类肠团的生成效率和出芽指数(P<0.05);5 mmol/L谷氨酸处理体外培养类肠团,可显著上调类肠团中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白质β-catenin、TCF4、c-Myc、Cyclin D1的表达水平(P<0.05),促进干细胞标志Lgr5和Bmi1的表达(P<0.05)。结论:谷氨酸可通过激活Wnt/β-catenin信号通路增强猪肠道干细胞活性,促进肠上皮细胞增殖,从而促进断奶仔猪肠道发育,提高养分消化率。
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