目的:胶质瘤是原发性恶性脑肿瘤中发病率最多的类型,其发病原因有待进一步探究。到现在为止,临床上针对胶质瘤的常规治疗方式仍难以达到满意的疗效,加之容易产生放化疗耐药,这都使得胶质瘤患者的预后极差。因此,探寻和开发新型有效的抗胶质瘤药物是当前基础和临床研究中亟待解决的问题。柯里拉京(Corilagin,Cor)是从叶下珠、蜜柑草、龙眼等多种天然植物中提取的有效单体化合物。目前研究表明,Corilagin具有抗炎、抗病毒、抗氧化及抗肿瘤等多种生物学活性,但是关于Corilagin抗胶质瘤的作用却鲜有报道。本研究旨在探索Corilagin对脑胶质瘤U251细胞凋亡与自噬的影响及机制,为Corilagin成为胶质瘤的潜在治疗药物提供新的研究证据。内容:培养U251细胞,采用不同浓度Corilagin(0,25,50,100μg/ml)处理U251细胞,光镜下观察处理前后培养的U251细胞的形态和密度,检测柯里拉京对人正常肝细胞LO2的细胞毒性及对U251细胞的抑制作用,检测细胞凋亡和细胞周期的变化,检测细胞的迁移和侵袭能力。透射电镜观察Corilagin处理后U251细胞内自噬小体的特征,LC3双标腺病毒感染U251细胞观察细胞自噬水平的变化,检测PI3K/AKT/m TOR信号通路和下游相关分子及自噬相关基因m RNA和蛋白质的表达水平。方法:首先,采用CCK-8法检测Corilagin对人正常肝细胞LO2的细胞毒性和对U251细胞生长的抑制作用;其次,采用Hoeschst 33342染色,荧光显微镜观察细胞核的凋亡形态;采用Annexin V-FITC/PI试剂盒染色,流式细胞术检测细胞凋亡的比例;PI染液单染,流式细胞术检测细胞周期的变化;再次,细胞划痕(伤口愈合)实验检测U251细胞的迁移能力,Transwell侵袭实验检测U251细胞的侵袭能力;然后,透射电镜检测U251细胞内自噬小体的数量和形态特征,用LC3双标腺病毒感染U251细胞,荧光显微镜观察U251细胞自噬水平的变化;最后,RT-PCR和Western Blot技术检测PI3K/AKT/m TOR信号通路和下游相关分子及自噬相关基因m RNA和蛋白质表达水平的变化。结果:1.Corilagin浓度在100μg/ml以下时对人正常肝细胞LO2无明显细胞毒性,然而能够显著抑制胶质瘤U251细胞的增殖,并且Corilagin对U251细胞增殖的抑制作用表现为浓度依赖性和时间依赖性;2.正常U251细胞形态饱满,生长状态良好;Corilagin干预U251细胞皱缩变形,贴壁细胞的密度随Corilagin浓度的增加而明显降低,且培养基中逐渐出现较多悬浮的细胞碎片;3.不同浓度Corilagin处理U251细胞,Hoechst 33342染色后,荧光显微镜下见细胞核着色明亮,染色质皱缩,并且可以观察到典型的凋亡小体;Annexin V-FITC/PI染色,流式细胞术检测结果显示Corilagin能够诱导U251细胞凋亡;4.不同浓度Corilagin处理U251细胞,PI单染,流式细胞术检测结果显示Corilagin能够诱导U251细胞停滞于S期;5.细胞划痕实验表明,不同浓度Corilagin处理U251细胞48 h后,50μg/ml和100μg/ml Corilagin处理组U251细胞的伤口愈合能力低于对照组;Transwell细胞侵袭实验结果显示,50μg/ml和100μg/ml Corilagin处理组U251细胞的穿膜能力减弱;6.100μg/ml Corilagin干预U251细胞,透射电镜下可以看到明显增多的自噬泡,表现为典型双层膜结构的自噬小体形态;7.通过预实验探索得出LC3双标自噬腺病毒感染U251细胞最佳MOI值为40,100μg/ml Corilagin处理后的U251细胞内出现大量自噬体和自噬溶酶体,表明Corilagin能够诱导U251细胞发生自噬;8.RT-PCR和Western Blot结果表明,Corilagin能够显著抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路的激活,影响下游相关基因m RNA和蛋白质的表达,进而促进细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭、诱导细胞发生自噬。结论:1.在对LO2细胞无明显细胞毒性的浓度条件下,Corilagin对U251细胞的存活率具有明显的抑制效应,Corilagin这种抗胶质瘤的药理作用与促进细胞凋亡、诱导细胞S期停滞、抑制细胞迁移和侵袭能力有关。Corilagin的抗胶质瘤生物学活性可能是通过抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路及下游相关分子的表达发挥作用的;2.通过电镜观察细胞超微结构及LC3双标自噬腺病毒感染细胞实时观察自噬流的变化,我们认为Corilagin的抗胶质瘤活性还可能与诱导细胞自噬,进而促使细胞发生自噬性死亡有关,其具体机制可能与上调Beclin-1和ATG9B的表达有关。