周围神经损伤常常会引起神经病理性疼痛，主要表现为痛超敏，即痛阈下降；痛觉过敏，即痛反应增强和自发性疼痛。但迄今为止，神经病理性疼痛的机制仍然不清楚。 最近的研究表明炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)在神经病理性疼痛的产生过程中发挥重要作用。抑制TNF-α的合成或拮抗其受体可减轻神经病理性疼痛。坐骨神经内注射低剂量的TNF可以引起大鼠机械性痛阈下降和热痛反应增强，持续时间为几天。但是，TNF-α在体内的半衰期只有十几分钟，注射一次生理浓度的TNF-α为什么会引起如此长时间的病理性疼痛还不是很清楚。 以前的研究表明神经损伤可导致背根神经节(DRG)TNF-α及其受体1(TNFreceptor 1，TNFR1)的增加，而且许多表达有TNF-α的神经元同时表达有大量的TNFR1。这提示TNF-α可能是通过自分泌途径以引起神经病理性疼痛。在本实验中，我们发现坐骨神经周围给予10，100，1000 pg/ml重组大鼠肿瘤坏死因子(rrTNF，recombinant rat TNF-α，每天一次，共2天)可引起大鼠双侧后爪机械性痛阈下降和热痛反应增强，即镜像痛，持续约20天。然后在坐骨神经周围施加100 pg/ml rrTNF(Peri-sciatic administration ofrrTNF，以下简称PST)后不同时间点，用免疫组织化学方法检测了L4，L5 DRG及腰膨大脊髓背角TNF-α及其受体1的表达情况。结果发现同侧(非对侧)L4，L5 DRG TNF-α及其受体1的免疫活性分别于给药后第1，3天增高。免疫荧光双染发现增高的TNF-α免疫活性主要位于DRG的神经元，少量位于卫星细胞，而受体1主要位于神经元。腰膨大双侧脊髓背角TNF-α免疫活性第3天开始显著增加，一直持续到第14天，位于胶质细胞和神经元。TNFR1免疫活性在给药后一直未发生显著变化。另外，我们还发现PST后6天，同侧L4，L5 DRG内Nav1.3表达显著增强。实验最后还观察到PST前30分钟，鞘内注射NF-kB抑制剂PDTC可完全抑制rrTNF诱导的机械痛敏及TNF-α，TNFR1的表达增高。这些结果提示外源性的低剂量TNF-α可能是通过自分泌途径，也就是说可能是通过先作用于感觉神经元上的TNFR1，然后激活NF-kB信号通路，从而引起自身的产量增加以引起大鼠长时间的机械刺激痛觉过敏。 第1部分坐骨神经周围给予rrTNF引起大鼠双侧后爪机械刺激和热刺激痛觉过敏。最近的研究表明炎症细胞因子，如TNF-α在神经病理性疼痛的产生过程中起作用。抑制TNF-α的合成或拮抗TNF-α的受体可以减轻病理性疼痛。大鼠坐骨神经内膜内注射TNF可以引起机械性痛阈下降和热痛反应增强，持续时间为几天。但坐骨神经内膜注射也会损伤神经。在完全没有神经损伤的情况下，单纯外源性TNF-α是否能引起神经病理性疼痛还不清楚。本研究拟用行为学测试的方法观察坐骨神经周围给予重组大鼠TNF-α是否能产生类似于神经损伤以后的痛行为学变化。结果发现10， 100，1000 pg/ml rrTNF(每天一次，共2天)可引起大鼠双侧后爪机械性痛阈下降和热反应增强，持续约20天。坐骨神经周围给予1pg/mlrrTNF后，大鼠双侧后爪50﹪机械刺激撤足阈值和热刺激潜伏期无变化。100pg/ml组与1000 pg/ml组产生的机械性刺激与热刺激痛觉过敏的程度无明显差别。坐骨神经周围给予200μl 0.1﹪BSA(rrTNF溶剂)对大鼠双侧后爪50﹪机械刺激撤足阈值和热刺激潜伏期无任何影响。肌肉内(靠近而不接触坐骨神经)给予rrTNF(1000 pg/ml，200 μl，每天一次，共两天)对大鼠双侧后爪50﹪机械刺激撤足阈值和热刺激潜伏期无影响。上述结果提示在完全不损伤神经的情况下，坐骨神经周围给予低剂量的rrTNF可通过神经途径而不是血液途径引起神经病理。 第2部分坐骨神经周围给予rrTNF引起TNF-α及TNFR1在背根神经节和TNF-α在脊髓背角的表达增高。本实验第一部分已经观察到rrTNF可引起大鼠双侧后爪机械痛阈下降和热刺激反应增强。以前有实验报道向坐骨神经施加TNF-α可引起Aδ纤维和C纤维的自发放电。离体时TNF可引起正常DRG神经元短时间放电。很明显细胞因子对痛觉传导通路中神经元的急性兴奋作用在神经病理性疼痛的产生中起作用。然而，TNF-α的半衰期只有十几分钟，如此低剂量的rrTNF是如何引起长达20天的神经病理性疼痛的呢?以前的研究发现通过腰5前根切除以选择性的损伤运动神经纤维而不损伤感觉神经元，也可以使大鼠产生双侧后爪神经病理性疼痛的行为学变化，同侧L4和L5 DRG及双侧腰五脊髓背角的TNF-α及TNFR1明显增高。更重要的是，我们发现DRG的大多数神经元表达有过量TNF-α的同时也表达有大量TNFR1。这提示TNF-α可能通过自分泌途径以发挥作用。因此在这部分实验中，我们在施加100 pg/ml rrTNF后不同时间点，用免疫组织化学和免疫荧光双染的方法检测L4，L5 DRG及脊髓背角TNF-α及其受体1的表达情况和细胞类型。结果发现，PST可引起TNF-α及其受体l在同侧L4，L5 DRG和TNF-α在腰膨大双侧脊髓背角的增高。在DRG，与对照组相比，PST后1天，TNF-α的免疫活性开始增高，3天时其受体1的免疫活性开始增高，6天时达到高峰，显著性差异可维持2周左右。免疫荧光双染发现增多的TNF-α主要位于神经元，少量位于卫星细胞，而受体1的上调仅局限于神经元。在脊髓，PST后3天，腰膨大双侧脊髓背角TNF-α免疫活性阳性面积百分比显著增加，维持至第14天。免疫双染发现TNF-α的上调既可见于胶质细胞，也可见于神经元。以上结果说明外源性TNF-α可引起TNF-α及其受体1的增多，也就是说坐骨神经周围给予rrTNF可能是通过自分泌途径引起病理性疼痛的。 第3部分NF-kB信号转导途径在坐骨神经周围给予rrTNF引起痛觉过敏中的作用。TNF-α与其受体1结合以后，主要通过激活NF-kB信号转导途径以发挥作用。在这部分实验中，我们首先观察了NF-kB的抑制剂，PDTC对rrTNF引起机械性痛敏和热痛敏的影响。结果发现每次坐骨神经周围给予rrTNF前30分钟鞘内注射PDTC(8.2 ng/10μl)可完全防止大鼠双侧后爪50﹪机械刺激撤足阈值的下降，而热刺激撤足潜伏期的下降也显著延迟；相反的，第一次坐骨神经周围给予rrTNF后6天，再鞘内给予同等剂量的PDTC对已经形成的机械性痛敏无作用，对热痛敏却有短暂的抑制作用，鞘内注射生理盐水对rrTNF引起机械痛敏和热痛敏无显著影响。PST前给予PDTC可能是通过抑制TNF-α及TNFR1的增高以阻止机械性痛觉过敏的产生的，因此我们进一步在6只PST前30分钟鞘内给予PDTC的大鼠上进行了实验，结果发现此组大鼠L5 DRG的TNF-α，TNFR1免疫活性和脊髓的TNF-α免疫活性均显著下降。此结果提示TNF-α与NF-kB之间的正反馈可能在rrTNF引起的大鼠机械刺激痛觉过敏的产生中起重要作用。外源性TNF-α仅通过激活NF-kB以引起内源性的TNF-α增加从而引起神经病理性疼痛。 结论： 1.在完全不损伤神经的情况下，坐骨神经周围给予低剂量的重组大鼠肿瘤坏死因子-α可引起大鼠双侧后爪机械刺激和热刺激痛觉过敏，持续约20天。(我们把这一模型命名为PST模型)2. PST可引起TNF-α，TNFR1在同侧L4，L5 DRG以及TNF-α在腰膨大双侧脊髓背角的表达增高。 3.PST引起的TNF-α表达增强，在DRG主要位于神经元，少量位于卫星样胶质细胞，在脊髓背角也发现于胶质细胞和神经元。但TNFR1的上调仅存在于DRG神经元。 4.PST前30分钟鞘内给予PDTC可完全防止rrTNF引起机械性痛阈下降，而PST后6天给予同等剂量的PDTC对已经形成的机械性痛觉过敏无作用。说明NF-kB途径的激活可能在大鼠机械刺激痛觉过敏的产生过程中起作用，而在维持中不起作用。 5.PST前30分钟鞘内给予PDTC可显著降低rrlNF所引起L5 DRG TNF-α，TNFR1的增高，及腰膨大双侧脊髓背角TNF-α的增高。 6.TNF-α可能是通过自分泌途径，也就是说TNF-α可能是作用于感觉神经元上持续表达的TNFR1，然后激活NF-kB途径以产生更多的TNF-α，从而引起大鼠机械刺激痛觉过敏的。