乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,已位居妇女恶性肿瘤死因的首位。我国乳腺癌的发病率虽相对于西方欧美国家较低,但近年来随着人们生活水平的提高和生活方式的改变,其发病率呈上升趋势,全国平均乳腺癌死亡率已达2.61/10万人次。现阶段乳腺癌治疗主要采取手术为主的综合治疗,包括放疗、化疗和内分泌治疗等。经大量随访发现,Ⅱ-Ⅲ期患者虽然经手术治疗或放化疗,5年内仍有60-70%患者出现复发转移,而远端转移是乳腺癌患者死亡的主要原因之一。近期研究表明,乳腺癌细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)是其发生转移的主要原因,EMT是指具有极性的细胞获得自由移动于细胞基质间的能力的过程,以上皮表型缺失和间质表型获得为主要特征。乳腺癌细胞通过EMT获得更强的移动和侵袭能力,穿过细胞外基质及血管基底膜进入循环系统,进而形成远处继发性转移灶,是乳腺癌转移的关键步骤。因此,寻找参与调节乳腺癌细胞EMT的分子标记物能够作为乳腺癌预后的指标,而且以此为靶点,在深入研究其调节乳腺癌细胞侵袭转移的分子机制基础上,研发相应的个性化治疗手段,是当前乳腺癌研究领域的热点。泛素是由76个氨基酸残基组成的多肽,其介导的蛋白质降解途径受到严格的时空调控。在ATP的作用下,泛素被泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)激活后转移至泛素偶联酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2),再由泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3)将泛素转移到特定的底物上,最后被泛素修饰的底物进入蛋白酶体(proteasome)进行降解。E3泛素连接酶在蛋白质降解过程中发挥着关键的作用,决定着反应的特异性。CUL4A是发现较晚的一类泛素连接酶,与DDB1蛋白及Roc1相互作用构成E3复合体(CUL4A-DDB1-Rocl)。CUL4A在肿瘤中的研究始于乳腺癌,在原发性乳腺癌中大量扩增或过表达。随后的研究表明,在鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌、神经管细胞瘤、肝癌和恶性胸膜间皮瘤中也存在着CUL4A扩增。最近,全基因组SNP数组分析揭示了在部分肺癌和卵巢癌以及其它实体瘤中也同样存在CUL4A基因扩增。而且,CUL4A高表达能促进细胞增殖,其表达水平与总生存率和无病生存率有密切相关性,这表明CUL4A的异常调节可能促进肿瘤形成。然而,CUL4A是否能够调控肿瘤细胞的EMT以及肿瘤侵袭转移尚未见研究报道。本研究主要集中于CUL4A调控乳腺癌细胞EMT以及侵袭转移的作用,并深入研究其可能的分子机制,本研究的成功实施不仅丰富了CUL4A在乳腺癌中的生物学功能,而且还为探讨新的乳腺癌侵袭转移的治疗方法提供了新的研究靶点。第一部分E3泛素连接酶CUL4A与肿瘤转移的相关性研究[目的]应用常见细胞株和组织芯片研究在恶性程度不同的细胞中以及不同肿瘤类型中CUL4A的表达,并分析CUL4A与肿瘤转移的关系,为进一步明确CUL4A在乳腺癌侵袭转移中的作用奠定基础。[方法]1.应用本实验室保藏的常见肿瘤细胞株,通过qRT-PCR和Western blot检测不同细胞株中CUL4A的表达情况。2.应用Biomax生物公司的乳腺癌组织芯片(BR954),通过免疫组织化学法检测CUL4A在正常乳腺组织、原位癌组织和具有转移特性的乳腺癌组织中的表达情况。3.应用Biomax生物公司的胃癌组织芯片(ST8041),通过免疫组织化学法检测CUL4A在正常胃组织、原位癌和具有转移特性的胃癌组织中的表达情况。4.应用Biomax生物公司的卵巢组织芯片(OV2089),通过免疫组织化学法检测CUL4A在正常卵巢组织、原位癌和具有转移特性的卵巢癌组织中的表达情况。5.应用Biomax生物公司的结肠癌组织芯片(C020814),通过免疫组织化学法检测CUL4A在正常结肠组织、原位癌和具有转移特性的结肠癌中的表达情况。[结果]1. qRT-PCR结果显示CUL4A mRNA表达水平在正常乳腺癌上皮细胞中(MCF10A)表达最低,在非侵袭性乳腺癌上皮细胞中(MDA-MB-468、 MCF7、HCC1569)表达较高,而在侵袭性乳腺癌细胞中(MDA-MB-231、 BT549)表达水平最高。2. Western blot结果显示在各型细胞株中CUL4A的蛋白表达水平与其mRNA表达水平相一致,即在正常乳腺癌上皮细胞中(MCF10A)表达最低,在非侵袭性乳腺癌上皮细胞中(MDA-MB-468、MCF7、HCC1569)表达较高,而在侵袭性乳腺癌细胞中(MDA-MB-231、BT549)表达最高。3.通过免疫组织化学法检测乳腺癌组织芯片中CUL4A的蛋白表达结果表明正常乳腺中CUL4A表达较低,原位癌中表达较高,而具有远处转移的乳腺癌中CUL4A的表达最显著。4.通过免疫组织化学法检测胃癌组织芯片中CUL4A的蛋白表达结果表明正常胃组织中CUL4A表达较低,原位癌中表达较高,而具有远处转移的胃癌中CUL4A的表达最显著。5.通过免疫组织化学法检测卵巢癌组织芯片中CUL4A的蛋白表达结果表明正常卵巢组织中CUL4A表达较低,原位癌中表达较高,而具有远处转移的卵巢癌中CUL4A的表达最显著。6.通过免疫组织化学法检测结肠癌组织芯片中CUL4A的蛋白表达结果表明正常结肠组织中CUL4A表达较低,原位癌中表达较高,而具有远处转移的结肠癌中CUL4A的表达最显著。[结论]1.CUL4A在各型乳腺细胞株中表达不同,侵袭性强的细胞株中表达高,侵袭性低的表达较低,表明CUL4A表达水平与乳腺癌细胞的侵袭性密切相关。2.不同类型肿瘤的组织芯片免疫组化结果证明,具有转移特性的肿瘤组织中CUL4A表达增加显著,而原位癌CUL4A表达相对较低,表明CUL4A与肿瘤的侵袭转移具有显著相关性。第二部分CUL4A促进乳腺癌细胞上皮间质转化及侵袭转移的作用研究[目的]第一部分研究结果提示CUL4A可能具有促进乳腺癌迁移、转移的能力。为此,本部分通过体外细胞实验和裸鼠体内转移模型实验检测CUL4A是否具有诱导乳腺癌细胞EMT发生和远处转移的作用。[方法]1.通过逆转录病毒转染pBabe-CUL4A及其空白对照质粒,在CUL4A低表达的MDA-MB-468和MCF7细胞系中构建CUL4A过表达的细胞株及其对照(MDA-MB-468-pBabe、MDA-MB-468-pBabe-CUL4A、MCF7-pBabe、 MCF7-pBabe-CUL4A)。嘌呤霉素筛选后应用qRT-PCR和Western blot验证CUL4A表达改变。2.通过逆转录病毒转染pSuper-shCUL4A及其空白对照质粒,在CUL4A表达较高的MDA-MB-231和BT549细胞系中构建CUL4A低表达的细胞株及其对照(MDA-MB-231-pSuper、MDA-MB-231-pSuper-shCUL4A、BT549-pSuper、 BT549-pSuper-shCUL4A).嘌呤霉素筛选后应用qRT-PCR和Western blot验证CUL4A表达改变。3.分别应用上述构建成功的CUL4A稳定沉默或上调的细胞株,通过光镜下观察细胞形态以及应用qRT-PCR、Western blot、激光共聚焦结合免疫荧光染色等技术检测EMT相关标记分子(E-cadherin、a-catenin、N-cadherin、Vimentin等)的表达,观察CUL4A调控乳腺癌细胞EMT的作用。4.应用上述构建成功的稳定转染的细胞株,通过细胞划痕实验、Transwell小室迁移实验检测CUL4A调控乳腺癌细胞迁移能力的作用；通过Matrigel侵袭实验检测CUL4A调控乳腺癌细胞侵袭能力的作用。5.应用稳定转染高表达CUL4A的乳腺癌细胞株及其空白对照建立裸鼠异种移植瘤模型和远处转移瘤模型,观察肿瘤转移情况,研究上调CUL4A表达是否能够促进乳腺癌细胞的侵袭转移。6.应用稳定转染CUL4A抑制序列的乳腺癌细胞株及其空白对照构建裸鼠异种移植瘤模型和远处转移瘤模型,观察肿瘤转移情况,研究下调CUL4A表达是否能够抑制乳腺癌细胞的侵袭转移。7.通过qRT-PCR、Western blot以及免疫组织化学染色等方法检测各组瘤体和转移灶中CUL4A、E-cadherin、和Vimentin等表达的改变,进一步验证体外实验所证实的EMT改变。[结果]1.成功构建成稳定转染CUL4A的乳腺癌细胞株及其空白对照(MDA-MB-468-pBabe、MDA-MB-468-pBabe-CUL4A、MCF7-pBabe MCF7-pBabe-CUL4A)。2.成功构建成稳定转染CUL4A干扰序列的的乳腺癌细胞株及其空白对照(MDA-MB-231-pSuper、MDA-MB-231-pSuper-shCUL4A、BT549-pSuper、 BT549-pSuper-shCUL4A)3. CUL4A促进间质细胞标志分子N-cadherin、Vimentin的表达,抑制上皮细胞标志分子E-cadherin、a-catenin的表达。4. CUL4A能够促进乳腺癌细胞形态从上皮细胞向间质细胞转化。5. CUL4A促进乳腺癌细胞体外运动和侵袭能力。6.体内转移瘤实验表明,CUL4A具有促进乳腺癌细胞体内侵袭转移的能力。[结论]1. CUL4A具有调控乳腺癌上皮细胞发生EMT的作用。2.体内外实验表明CUL4A能够促进乳腺癌细胞的运动、侵袭和转移能力。第三部分CUL4A促进乳腺癌细胞上皮间质转化和侵袭转移作用的分子机制研究[目的]临床标本检测以及体内外实验表明CUL4A具有促进乳腺癌细胞EMT和侵袭转移的能力,但其具体的作用机制尚未有文献报道,本部分主要目的旨在通过系列实验明确其可能的分子机制。[方法]1.Affymetrix (昂飞)GeneChip Human U133Plus2.0cartridge基因芯片检测过表达CUL4A对乳腺癌细胞MDA-MB-468基因表达谱的影响,筛选可能的调控机制。2.在稳定转染的乳腺癌细胞系中,应用qRT-PCR和Western blot验证基因芯片结果中与EMT密切相关的转录因子ZEB1的表达。3.Western blot检测组蛋白H3甲基化改变情况。4.染色质免疫共沉淀结合qPCR技术检测CUL4A对H3K4me3结合ZEB1启动子能力的影响。5.在MDA-MB-468-pBabe-CUL4A细胞中通过逆转录病毒转染系统,构建稳定下调ZEB1表达的细胞株及其对照。6. Western blot检测上述细胞中EMT标记分子的改变。7.应用上述构建成功的稳定转染的细胞株,通过细胞划痕实验、Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力；通过Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭能力。8.应用上述构建成功的稳定转染的细胞株,构建裸鼠异种移植瘤模型和远处转移瘤模型,观察肿瘤转移情况,研究下调ZEB1表达是否能够阻断CUL4A介导的乳腺癌细胞侵袭转移。9.应用Biomax生物公司的乳腺癌组织芯片(BR954),通过免疫组织化学法检测ZEB1在正常乳腺组织、原位癌和转移癌中的表达情况,并分析ZEB1的表达与CUL4A表达的相关性。[结果]1.基因芯片结果表明CUL4A表达增加能够显著促进EMT关键调节因子ZEB1的表达,qRT-PCR以及Western blot结果同样也证明在稳定转染CUL4A的细胞中CUL4A能够调节ZEB1的表达。2.稳定转染细胞中的组蛋白H3甲基化位点的检测表明,CUL4A能够促进H3K4的三重甲基化(H3K4me3)。3.染色质免疫共沉淀结果表明,CUL4A能够促进H3K4me3与ZEB1基因启动子的结合。4.干扰ZEB1表达后能够抑制CUL4A高表达导致的EMT改变。5.干扰ZEB1表达后能够抑制CUL4A导致的细胞运动和侵袭能力的改变。6.体内实验也表明干扰ZEB1表达后能够抑制CUL4A导致的乳腺癌细胞体内远处转移能力的改变。7.组织芯片检测ZEB1表达显示,在转移性乳腺癌中,ZEB1表达最高,而在正常或原位癌中ZEB1表达较低。8.相关性分析提示,乳腺癌组织中CUL4A表达与ZEB1的表达呈显著的正相关性。[结论]1.CUL4A通过促进H3K4的三重甲基化(H3K4me3),而H3K4me3结合于ZEB1的启动子部位促进ZEB1的转录和表达。2. ZEB1介导CUL4A促进乳腺癌细胞EMT和转移的作用。