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研究背景:胶质瘤（Glioma）是最常见的中枢神经系统原发性颅内肿瘤,占恶性原发脑肿瘤的80%左右,可发病于任何年龄。胶质瘤发展迅速,侵袭性强,且预后差。近年来,尽管胶质瘤的治疗已在手术、放疗、化疗和靶向治疗等方面取得了进展,但治疗效果仍然不尽人意。手术切除后的复发仍是目前胶质瘤治疗面临的重大难题。已有研究表明胶质瘤干样细胞是胶质瘤复发的主要原因。因此,研究胶质瘤干样细胞在胶质瘤发生发展中的作用及机制,可为胶质瘤治疗提供新的有效靶点。胶质瘤中存在少量具有高致瘤性的胶质瘤干样细胞（Glioma stem-like cells,GSLCs）,GSLCs具有自我更新、无限增殖和多向分化的潜能,其在胶质瘤治疗后的复发、放疗抵抗和化疗耐药中起着关键作用,因此靶向GSLCs有可能成为改善胶质瘤患者预后的新治疗方法。Sohlh1（Spermatogenesis and oogenesis basic helix-loop-helix transcription factor 1）是碱性螺旋-环-螺旋（bhlh）转录因子家族的重要成员之一,其能与靶基因启动子区域的保守E-box序列结合,调节靶基因表达,参与细胞凋亡、分化、增殖等多种生物学行为。实验室前期研究已证实,Sohlh1是一个新的抑癌基因,可抑制胶质瘤细胞的侵袭、迁移和增殖,但其在GSLCs中的作用尚不明确。前期实验结果显示,Sohlh1在GSLCs中的表达明显下调,提示Sohlh1可能在GSLCs的干性维持和分化中发挥作用。Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育、神经系统的发生、细胞增殖和肿瘤干样细胞的干性维持中发挥着非常重要的作用,它的异常激活与多种肿瘤的发生发展紧密相关。当Wnt蛋白与细胞膜表面特异性受体蛋白结合后,导致胞质中β-catenin积累并向细胞核内转移,与LEF/TCF转录因子结合,增加下游靶基因C-myc、Cyclin D1的表达,促进GSLCs的干性维持。分泌型卷曲相关蛋白 1（Secreted Frizzled-relatedprotein1,SFRP1）是 Wnt/β-catenin 信号通路的抑制分子,可通过与 Wnt 受体（FZD）竞争性地结合 Wnt 配体,阻止Wnt-FZD-LRP5/6复合物的形成,抑制Wnt/β-catenin信号传导。已证实,SFRP1为胶质瘤中的一个抑癌基因,但其在GSLCs中的表达调控机制尚不明确。实验室前期研究已证实,Sohlh1可阻断Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制肿瘤细胞迁移、增殖和侵袭,因此我们推测,Sohlh1可能通过调控SFRP1的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,进而调控GSLCs的干性维持和分化。研究方法:（1）研究Sohlh1对GSLCs干性的影响体外培养人来源的胶质瘤细胞系U87MG和U251,采用慢病毒转染的方法,构建过表达Sohlh1和敲减Sohlh1的稳转细胞系,用无血清培养基在低粘附性皿中富集GSLCs。通过q-PCR、Western-blot实验,检测Sohlh1对GSLCs标记物Nestin、CD133、CD44、SOX2、OCT4表达的影响。通过克隆形成实验、CCK-8、免疫荧光染色、FACS,检测Sohlh1对GSLCs干性的影响。（2）研究Sohlh1对GSLCs分化的影响通过干细胞诱导分化实验,研究Sohlh1对GSLCs分化的影响。通过q-PCR、Western-blot、免疫荧光染色,检测Sohlh1对GSLCs分化标记物MAP2、GFAP、MBP表达的影响。（3）在体实验研究Sohlh1对GSLCs颅内成瘤的影响利用脑立体定位仪,将对照和过表达Soh1h1的U87MG-Luc GSLCs注入裸鼠颅内（1× 106个/只）。三周后,通过生物发光成像系统,观察Sohlh1对颅内肿瘤生长的影响。取裸鼠脑肿瘤,采用免疫荧光染色、q-PCR、Western-blot、免疫组化等实验方法,分析裸鼠脑种植肿瘤组织中干性和分化相关标记物的表达情况。（4）研究Sohlh1是否通过调控SFRP1表达抑制GSLCs中Wnt/β-catenin信号通路激活利用GSLCs和裸鼠脑种植肿瘤组织,通过q-PCR、Western-blot实验,检测Sohlh1 对 SFRP1 及 Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因 C-myc、Cyclin D1、MMP2、MMP9表达的影响。通过TOP flash/FOP flash双荧光素酶报告实验,研究Sohlh1是否抑制GSLCs中Wnt/β-catenin信号通路激活。利用ChIP、双荧光素酶报告实验,研究Sohlh1是否直接调控SFRP1的表达。通过转染SFRP1过表达和敲减质粒,研究SFRP1是否介导Sohlh1对GSLCs干性和分化的调控。（5）研究胶质瘤临床样本中Sohlh1与Nestin、SFRP1表达的相关性对胶质瘤临床样本的芯片进行免疫组化染色,分析胶质瘤组织中Sohlh1与Nestin、SFRP1 的相关性。研究结果:（1）Sohlh1 抑制 GSLCs 干性q-PCR、Western-blot结果显示,过表达Sohlh1抑制GSLCs标记物Nestin、CD133、CD44、SOX2、OCT4的表达,敲减Sohlh1则这些基因的表达上调（P＜0.01）;克隆形成结果显示,过表达Sohlh1明显减少GSLCs克隆球的大小和数量（P＜0.001）,敲减Sohlh1则增加GSLCs克隆球的大小和数量（P＜0.01）;CCK-8结果显示,Sohlh1可明显降低GSLCs活性,敲减Sohlh1则增强其活性;免疫荧光染色结果显示,过表达Sohlh1降低GSLCs标记物Nestin和CD133的表达,敲减Sohlh1促进Nestin和CD133的表达;FACS结果显示,过表达Sohlh1明显降低Nestin和CD133双阳性GSLCs的比例（P＜0.001）,敲减Sohlh1观察到Nestin和CD133双阳性GSLCs的比例增高（P＜0.01）。（2）Sohlh1 促进 GSLCs 分化干细胞诱导分化实验显示,在含1%血清的培养基中,过表达Sohlh1组GSLCs分化明显多于对照组,敲减Sohlh1组GSLCs分化少于对照组;q-PCR、Western-blot、免疫荧光染色结果显示,过表达Sohlh1上调GSLCs分化标记物MAP2、GFAP、MBP的表达,敲减Sohlh1则结果相反（P＜0.01）。（3）Sohlh1抑制GSLCs颅内种植瘤的生长活体成像、HE染色结果显示,过表达Sohlh1明显抑制裸鼠颅内肿瘤的生长;q-PCR、Western-blot、免疫荧光、免疫组化实验结果均表明,过表达Sohlh1抑制Nestin、CD133、CD44、SOX2、OCT4 表达,促进 MAP2、GFAP、MBP 表达（P＜0.01）。（4）Sohlh1通过调控SFRP1表达抑制GSLCs中Wnt/β-catenin信号通路激活q-PCR、Western-blot实验结果显示,Sohlh1上调SFRP1的表达,下调Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因C-myc、Cyclin D1、MMP2、MMP9表达,敲减Sohlh1则结果相反;TOP flash/FOP flash双荧光素酶报告实验结果显示,Sohlh1抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,敲减Sohlh1则促进Wnt/β-catenin信号通路的激活（P＜0.05）。ChIP、双荧光素酶报告实验结果显示,Sohlh1可与SFRP1的启动子结合,直接调控SFRP1的表达;Sohlh1过表达/敲减GSLCs转染SFRP1敲减/过表达质粒后,q-PCR、Western-blot实验结果显示SFRP1可介导Sohlh1对GSLCs标记物及Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因表达的抑制作用,以及对GSLCs分化的促进作用。（5）在临床样本中,Sohlh1与Nestin的表达呈负相关,与SFRP1的表达呈正相关胶质瘤临床样本免疫组化染色结果显示,Sohlh1与Nestin的表达呈负相关,与SFRP1的表达呈正相关（P＜0.001）。结论:（1）Sohlh1可抑制GSLCs干性,促进GSLCs分化。（2）Sohlh1通过上调SFRP1的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,进而发挥抑癌作用。