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第一部分氟暴露、突触结合蛋白10基因启动子区甲基化与儿童智力的关系目的:过量氟暴露可导致神经损伤,但其机制尚未完全阐明。本研究选择668名儿童开展横断面调查,旨在探讨氟暴露、突触结合蛋白10基因启动子区甲基化与儿童智力三者之间的关系。方法:根据历史水氟监测资料及水样检测结果,在天津市宝坻区氟病区(水氟浓度>1.0 mg/L)和非病区(水氟浓度≤1.0 mg/L)各随机抽取325名和343名7~13岁在校儿童作为调查对象。收集晨尿、外周血等生物样本,采用联合型瑞文测验进行智力测评,使用自制的调查表收集调查对象的一般信息,对调查对象进行体格检查并收集体检资料。使用氟离子选择电极检测尿样中氟离子浓度,并使用DNA提取试剂盒提取外周血中的DNA。从非病区组和病区组中随机选择性别、年龄匹配的10对儿童,利用Human Methyl-Seq法筛选氟暴露相关甲基化差异基因;利用定量甲基化特异性PCR法对668例儿童DNA样本进行目的基因甲基化水平的验证;使用两独立样本t检验对人群基本信息中的连续型变量进行比较;用?~2检验比较分类变量在两组中的分布差异;利用线性回归模型分析氟暴露、目的基因甲基化水平与儿童智商(intelligence quotient,IQ)的关系;利用logistic回归模型分析氟暴露与儿童智力等级、目的基因甲基化水平与儿童智力等级的关系。最后利用中介效应分析法分析目的基因甲基化水平改变在氟致儿童智力损失中的中介效应。结果:氟病区饮水氟浓度(2.41±0.72 mg/L)明显高于非病区(0.62±0.25 mg/L)(P<0.05),且病区组儿童尿氟浓度(2.57±0.78 mg/L)明显高于非病区组儿童(0.18±0.13 mg/L)(P<0.05),儿童IQ得分(105.78±11.65)明显低于非病区组(108.37±12.55)(P<0.05)。无论在病区组、非病区组或总人群中,男童与女童的IQ得分差异均无统计学意义(P>0.05)。与非病区组相比,病区组迟钝及以下智力儿童的比例较高,优秀及以上智力儿童的比例较低,差异均有统计学意义(P<0.05)。甲基化测序结果显示,共有7个差异甲基化区域(differentially methylated region,DMR)的甲基化水平受氟暴露的影响,其中1个DMR位于突触结合蛋白10(synaptotagmin 10,Syt10)基因启动子区的CpG岛上,而Syt10基因功能与神经发育有关。人群验证结果显示,病区组儿童Syt10基因启动子区甲基化水平(3.32%±1.27%)较非病区组儿童(3.11%±1.16%)明显升高(P<0.05)。水氟浓度每升高1 mg/L,Syt10基因启动子区甲基化水平升高0.12%(95%CI:0.02%,0.22%),儿童IQ得分降低1.00(95%CI:-1.85,-0.15)、儿童优秀及以上智力概率降低5%(OR=0.95,95%CI:0.92,0.97);尿氟浓度每升高1 mg/L,Syt10基因启动子区甲基化水平升高0.08%(95%CI:0.01%,0.16%),儿童IQ得分降低1.01(95%CI:-1.69,-0.33)、儿童优秀及以上智力概率降低4%(OR=0.96,95%CI:0.93,0.98)。Syt10基因启动子区甲基化水平每升高1%,儿童IQ得分降低2.56(95%CI:-3.39,-1.74),儿童优秀及以上智力概率、中上智力概率均降低5%(P<0.05),儿童迟钝及以下智力概率升高4%(P<0.05)。中介效应分析结果显示,水氟与儿童IQ得分降低关系的29.3%(95%CI:7.5%,68.1%)、尿氟与儿童IQ得分降低关系的20.8%(95%CI:6.2%,51.2%)由Syt10基因启动子区甲基化水平升高介导;水氟与儿童优秀及以上智力概率降低关系的16.3%(95%CI:5.4%,39.8%)及尿氟与儿童优秀及以上智力概率降低关系的14.8%(95%CI:4.9%,37.0%)由Syt10基因启动子区甲基化水平升高介导。结论:过量氟暴露可导致儿童智力损失,且与Syt10基因启动子区甲基化水平改变有关。第二部分Syt10基因启动子区甲基化、基因表达水平与氟神经毒性的关系目的:建立氟染毒动物模型和氟染毒细胞模型,分析神经组织和神经细胞中Syt10基因启动子区甲基化、Syt10转录及翻译水平与氟神经毒性的关系。方法:从湖北省疾病预防控制中心实验动物中心购置60只SPF级SpragueDewley(SD)大鼠(8周龄,180~220g,雌:雄=2:1),适应性喂养一周后,将大鼠随机分为四组:对照组和三个氟染毒组(10、50和100 mg/L Na F),并开始进行Na F染毒。染毒2月后按照雌雄比例2:1进行合笼,并将怀孕雌鼠单笼饲养。仔鼠断乳后染毒剂量仍与亲代相同,直至2月龄染毒结束。利用Morris水迷宫实验观察氟染毒对大鼠学习记忆能力的影响,并通过尼氏染色观察大鼠海马组织病理改变,利用透射电子显微镜观察海马神经元突触囊泡数目改变,Methyl TargetTM测序法检测海马组织中Syt10基因启动子区Cp G岛甲基化水平,real-time RT-PCR法检测Syt10 m RNA水平,western blot检测海马组织中Syt10蛋白表达水平,利用免疫组化法观察Syt10蛋白在海马组织中的表达及分布。同时,我们也建立了氟染毒大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞模型,利用CCK8法检测氟染毒PC12细胞的存活率,使用与氟染毒动物模型中相同的方法检测PC12细胞中Syt10基因启动子区甲基化水平、Syt10 m RNA和蛋白表达水平,并利用激光共聚焦显微镜观察PC12细胞中Syt10蛋白的定位表达情况。结果:水迷宫结果显示,定位巡航实验开始的第1天,各组大鼠逃避潜伏期无统计学差异(P>0.05);而实验第2~4天,各组逃避潜伏期均呈降低趋势,但氟染毒大鼠逃避潜伏期较对照组长(P<0.05);而在空间探索实验中,与对照组相比,50 mg/L Na F染毒大鼠和100 mg/L Na F染毒大鼠穿越平台次数明显减少(P<0.05)。尼氏染色显示,对照组海马中尼氏染色阳性细胞较多且分布密集,尼氏小体颜色较深、密度较大,随氟染毒浓度升高,海马中尼氏染色阳性细胞数目减少、排列松散,尼氏小体颜色变浅、密度降低。透射电镜结果显示,随氟染毒浓度升高,海马神经元突触前膜附近的突触囊泡数目减少。Methyl TargetTM测序结果显示,随氟染毒浓度升高,大鼠海马组织和PC12细胞中Syt10基因启动子区甲基化水平亦升高(P<0.05)。Real-time RT-PCR结果显示,随氟染毒浓度升高,大鼠海马组织和PC12细胞中Syt10 m RNA表达水平逐渐降低(P<0.05)。此外,western blot、免疫组化和共聚焦结果也显示,随氟染毒浓度升高,大鼠海马组织和PC12细胞中Syt10蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。结论:氟暴露可升高Syt10基因启动子区甲基化水平并降低Syt10 m RNA表达,从而导致Syt10蛋白表达降低、突触囊泡数目减少,进而导致神经毒性。