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本研究借鉴绵羊多胎主效基因研究的成果,利用生物信息学和分子生物学技术,克隆山羊多胎性状候选基因GDF9和BMP15,并检测基因突变,分析其与济宁青山羊多胎性能的关系,为济宁青山羊高繁殖力的标记辅助选择和多胎山羊育种提供理论依据。1、山羊GDF9基因全长的克隆与序列分析以发表的绵羊GDF9序列为基础,设计8对引物,采用PCR技术从山羊基因组中直接扩增GDF9基因片断,克隆测序后连接成完整的山羊GDF9基因(GenBank:EF446168)。生物信息学分析表明,序列全长5508bp,由两个外显子组成,第一外显子397bp,第二外显子965bp,共编码453个氨基酸,中间被1123bp的内含子隔开。将山羊GDF9基因全长与绵羊和牛进行BLAST比对,DNA的同源性分别达到97%和94%,编码序列同源性分别达到99%和96%,氨基酸序列同源性分别达到98.6%和95.58%。2、应用PCR-SSCP技术分析山羊GDF9基因外显子SNP_s根据山羊GDF9基因序列设计10对引物,采用PCR-SSCP技术检测GDF9基因外显子突变位点,结果发现在山羊GDF9编码序列第183bp、719bp、959bp、1189bp处分别发生了C→A、C→T、A→C、G→A的单碱基突变。序列分析显示C183A突变没有引起氨基酸的改变,C719T突变位点使蛋白质第240位氨基酸残基由由缬氨酸变为丙氨酸,A959C突变位点使第320位氨基酸残基由谷氨酰胺变为脯氨酸,G1189A突变位点导致第397位氨基酸残基由缬氨酸变为异亮氨酸。3、应用LDR技术分析山羊GDF9基因多态性及其对产羔数的影响应用LDR技术对济宁青山羊(234只)、鲁北白山羊(90)只、沂蒙黑山羊(84只)进行GDF9四个突变位点的群体检测,适合性x~2检验结果表明除白山羊在A959C突变位点处于非Hardy-Weinberg平衡状态外,其它各个群体在四个位点的基因频率均处于Hardy-Weinberg平衡状态。比较四个位点在三个品种中的基因型频率分布,济宁青山羊与沂蒙黑山羊之间,四个位点均没有显著差异,而济宁青山羊和鲁北白山羊之间,四个位点均有极显著差异(P＜0.01),鲁北白山羊和沂蒙黑山羊之间,在C183A、C719T和G1189A位点,均有极显著差异(P＜0.01),而在A959C位点,二者没有显著差异。利用SAS软件GLM过程对四个位点的的基因型效应和产羔数进行了最小二乘分析,结果表明C183A突变对济宁青山羊和鲁北白山羊产羔数没有显著影响。但对单胎品种沂蒙黑山羊的产羔数有显著影响(P＜0.05),各基因型效应值依次为CC(1.1715)＞AA(1.0897＞AC(1.0577)。C719T突变和A959C突变对济宁青山羊、鲁北白山羊、沂蒙黑山羊的产羔数均没有显著影响。G1189A突变对济宁青山羊产羔数没有显著影响,对鲁北白山羊产羔数有显著影响(P＜0.05),各基因型效应大小依次为AG(2.6014)＞GG(2.4416)＞AA(2.1806)。GDF9基因G1189A突变对济宁青山羊产羔数没有显著影响,各基因型效应大小依次为AG＞GG＞AA,与鲁北白山羊相一致。G1189A突变对沂蒙黑山羊产羔数有极显著影响(P＜0.01),各基因型效应值依次为AA(1.4574)＞AG(1.1136)＞GG(1.0781)。4、山羊BMP15基因全长的克隆与序列分析以发表的绵羊、牛的BMP15基因序列为基础,设计9对引物,采用PCR技术从山羊基因组中直接扩增BMP15基因片断,克隆测序后连接成完整的山羊BMP15基因(GenBank:EU743938)。生物信息学分析表明,序列全长6648bp,由两个外显子组成,第一外显子328bp,第二外显子851bp,共编码394个氨基酸,中间被5309bp的内含子隔开,把山羊BMP15基因全长与牛进行BLAST比对,DNA的同源性分别达到90.72%,与绵羊和牛比对,编码序列同源性均为98%,氨基酸序列同源性分别达到98%和97%。5、应用F-CSGE技术分析山羊BMP15外显子SNP_s根据山羊BMP15基因序列设计一对引物横跨整个第一外显子,设计两对引物覆盖第二外显子,应用荧光-构象敏感凝胶电泳(fluorescence-based conformation sensitive gel electrophoresis,F-CSGE)技术和DNA测序技术,搜索外显子的SNP_s,结果发现在山羊BMP15编码序列的第901bp处发生了A→G单碱基突变,该突变使得第301位氨基酸残基(成熟蛋白质第32位氨基酸)由丝氨酸变为苷氨酸,在编码区没有发现其它突变。6、应用LDR技术分析山羊BMP15基因多态性及其对产羔数的影响应用LDR技术对济宁青山羊(234只)、鲁北白山羊(90)只、沂蒙黑山羊(84只)进行BMP15基因突变位点的群体检测,三个品种均检测到BMP15基因突变的三种基因型,经卡方检验,鲁北白山羊和沂蒙黑山羊符合Hardy-Weinberg定律,而济宁青山羊不符合Hardy-Weinberg定律。在济宁青山羊和鲁北白山羊中,G为优势等位基因,而在沂蒙黑山羊中A为优势等位基因。利用SAS软件GLM过程对BMP15基因突变位点的的基因型效应和产羔数进行了最小二乘分析,结果表明BMP15突变位点的基因型对济宁青山羊产羔数没有显著影响,但对鲁北白山羊的产羔数有显著的影响(P＜0.05),各基因型效应值依次为GG(2.5621)＞AG(2.5350)＞AA(2.2257),证明BMP15基因A901G突变是影响鲁北白山羊产羔数的主效基因,而且含有G等位基因的个体产羔数较多,可以做为多胎分子标记。对沂蒙黑山羊的产羔数也有显著影响(P＜0.05),同样是含有G等位基因的个体产羔数多。7、应用LDR技术分析山羊FecB基因多态性及其对产羔数的影响应用LDR技术对济宁青山羊(234只)、鲁北白山羊(90)只、沂蒙黑山羊(84只)进行FecB基因突变位点的群体检测,发现济宁青山羊和鲁北白山羊存在FecB基因突变,在两个品种均检测到三种基因型,A等位基因(野生型)为优势等位基因,经卡方检验,济宁青山羊符合Hardy-Weinberg定律,而鲁北白山羊不符合Hardy-Weinberg定律。在单胎品种沂蒙黑山羊未检测到FecB基因突变。利用SAS软件GLM过程对FecB基因型效应和产羔数进行了最小二乘分析,结果表明FecB基因突变位点的基因型对济宁青山羊和鲁北白山羊产羔数均没有显著影响。对鲁北白山羊产羔数的影响虽然没有达到显著水平,但GG型(2.8656)和AG型(2.5370)的产羔数明显高于AA型(2.4341),特别是对于经产产羔数的影响更大,各基因型效应值依次为GG(3.1593)＞AG(2.5634)＞AA(2.5061),这一点和FecB基因对Booroola的影响模式相似。