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萝卜(Raphanus stivus L.),十字花科萝卜属一、二年生草本植物,是原产于我国的重要根菜类蔬菜作物。萝卜以膨大的肉质直根为主要产品器官,不仅营养丰富,而且富含糖、维生素和萝卜硫素等,具有较高的药用食疗价值。肉质直根发育的大小直接影响萝卜产量与品质。因此,研究萝卜肉质直根膨大的分子机理与遗传调控网络具有重要意义。萝卜肉质直根膨大是一个复杂的生物过程,包括形态发生和干物质积累等,前人研究主要集中在其结构形态与生理生化机制方面,但关于萝卜肉质直根膨大关键基因分离鉴定研究报道甚少,导致萝卜肉质根形成分子调控机制尚未完全阐明。鉴于此,本研究以萝卜高代自交系’NAU-YH’为试材,采用高通量转录组测序技术(RNA-seq)对萝卜肉质直根进行转录组de novo测序,并以转录组序列为参考基因,分析肉质直根膨大的数字基因表达谱和miRNA表达谱,分离鉴定萝卜肉质直根膨大相关基因与miRNA,以期为深入解析萝卜肉质直根膨大分子机制提供理论依据。主要研究结果如下:1.为系统获得萝卜肉质根转录组数据,本研究以萝卜不同发育时期(包括破肚前期、破肚期和膨大期)的肉质直根等量混样构建了1个cDNA文库,采用Illumina HiSeq 2000测序平台进行转录组测序。共获得51.17M clean reads数据,通过拼接得到70,168条unigenes,总长度为50.28 Mb,平均长度为717 nt,N50为636 nt。其中,63,991条unigenes(占总数91.20%)可比对到NCBI non-redundant(NR)、Gene Ontology(GO)、Clusters of Orthologous Group(COG)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)和核酸数据库(Nt)等公共数据库。GO分析表明所得unigenes主要参与生理代谢、催化反应、结合过程和细胞过程等。另外,基于KEGG pathway分析,分离鉴定出8个参与蔗糖代谢的酶家族(103个unigenes)。其中,通过基因克隆分析验证了转录组数据拼接所得2个萝卜蔗糖代谢基因RsSuSy1和RsSPS1基因序列,并通过RT-qPCR分析了6个蔗糖代谢相关基因的表达情况,结果显示所有基因在萝卜不同发育时期不同部位均有表达,且表达量呈动态变化。此外,基于转录组序列与同源克隆技术,克隆得到了萝卜肉质根形成相关RsCLE41和RsSAUR基因的基因组DNA及cDNA序列。其中,RsCLE41基因开放阅读框(ORF)为300 bp,推导编码99个氨基酸;RsSAUR开放阅读框长327 bp,编码108个氨基酸。利用RT-qPCR技术分析了萝卜肉质直根膨大过程中RsCLE41和RsSAUR基因的表达特征。结果表明,RsCLE41基因在萝卜根和茎中表达量相对较高,且在肉质直根破肚前期表达量最高。RsSAUR基因在破肚期表达量最高,破肚前期茎中表达量最高,其它时期根中表达量相对较高。本研究结果将为萝卜肉质直根膨大形成的分子机理和肉质直根膨大过程中关键基因分离鉴定提供了重要信息基础。2.为鉴定萝卜肉质直根膨大过程中的miRNA及其靶基因,本研究以萝卜肉质直根为试材,构建了破肚前期(10 DAS)、破肚期(20 DAS)、膨大期(40 DAS)三个小RNA文库,利用Solexa高通量测序技术鉴定到175个已知与107个新型miRNA;其中85个已知和13个新型miRNA在萝卜肉质根膨大过程中呈现显著性差异表达。此外,预测到差异表达miRNA的191个靶基因,包含转录因子和其他功能蛋白,可参与生长发育、细胞过程,信号感应和转导以及植物防卫反应等生物过程,并具有较好的结合能力和催化活性等分子功能。进一步分析表明,部分靶向基因(如NF-YA2、ILR1、bHLH74、XTH16、CEL41和EXPA9等)在萝卜肉质直根膨大过程中发挥重要作用。利用RT-qPCR技术对5个miRNA及其靶基因进行表达模式验证,发现4个miRNA表达模式与测序结果基本一致。研究结果为解析miRNA在萝卜肉质直根膨大过程中的分子调控机制提供理论依据。3.为系统分离萝卜肉质直根膨大关键基因,本研究构建了萝卜肉质直根破肚前期,(L1)、破肚期(L2)、膨大期(L3)三个cDNA文库,利用Illimina/HiSeq2000测序平台进行数字基因表达谱分析(DGE)。结果表明,在L1、L2和L3文库中分别获得7,219,043,7,047.977和7,161,612条clean reads,分别包含72,874,68,723和67,767个转录本。其中差异表达转录本分别为10,450个(L1 vs.L2)、12,325个(L1 vs.L3)与7,392个(L2 vs.L3)。GO富集分析表明差异表达转录本主要参与细胞代谢、单一生物过程以及胁迫响应等过程,并具有较好的结合能力和催化活性等功能;Pathway功能富集分析鉴定出127(L1 vs.L2)、126(L1 vs.L3)和122(L2 vs.L3)条代谢途径,其中植物激素信号转导(ko04075)和淀粉与蔗糖代谢(ko00500)包含差异转录本数量最多。此外,通过DGE和miRNAs关联分析,共鉴定到114对miRNA-mRNA(43特定miRNAs和92个基因),部分差异表达基因(如EXPA9、Cyclin、katanin、syntaxin、MADS-box、SAUR和CalS等)在萝卜肉质直根膨大过程中发挥重要作用。RT-qPCR分析表明15个(15/16)差异基因表达模式与RNA-seq分析结果基本一致。系列研究结果将为萝卜肉质直根膨大的分子机制研究奠定基础。