论文部分内容阅读
平战时核爆炸和次生核辐射会在军队和平民中产生大批核辐射伤员。对这些伤员进行有效救治的一个前提条件就是要快速准确了解每个伤员受照射的生物剂量，以便明确诊断、分类救治，这对辐射伤的早期诊断和救治具有非常重要的意义。既往主要使用染色体畸变进行生物剂量计算，虽然该方法稳定、可靠，但费时（2－3天）、费力（看片较慢），并且需要进行淋巴细胞培养，而重度辐射损伤的细胞增殖往往受到严重抑制，培养困难，因而这一方法的使用受到限制。近年来，研究者把辐射的“生物标志物”看好在微核上。大量的研究表明，微核实验的敏感性、特异性与染色体畸变分析基本相当，但微核实验要简便快速得多。1992年瑞典科学家Grawe发展了一种流式仪小鼠外周血网织红细胞微核自动检测技术，1993年我室曹佳发展并改进了这一技术，使其达到了实用化水平。但迄今为止，将这一技术用于人的监测效果并不理想，原因是含微核的网织红细胞极易被人脾脏清除，难以在外周血中检测到，使得这一方法直接用于人群监测遇到困难。另外，虽然应用流式细胞仪对人外周血淋巴细胞微核的检测也取得了较大进展，但是由于需要进行细胞培养，需时2-3天，并不适合于大批核伤员紧急诊断时使用。本研究拟在我室曹佳建立的小鼠红细胞微核流式仪自动化检测的基础上，建立一种适合于人外周血网织红细胞微核的快速瞬时流式仪自动化检测新技术，以便用于平战时大批伤员受照生物剂量的快速诊断和估算。据此：本研究首先以大鼠为模型，建立了单激光流式细胞仪大鼠骨髓嗜多染红细胞微核率（fMNPCE）自动检测方法；然后以接受放疗的鼻咽癌（NPC）患者为辐射伤员模型，采用双核淋巴细胞微核实验（CB-MNT），研究了双核淋巴细胞微核率（fMN-BNLs）与累积放疗剂量的关系；在上述工作基础上，成功建立了以NPC患者为模型的人外周血网织红细胞微核率（fMN-Ret）快速流式仪检测方法。主要结果如下：1、人外周血CB-MNT分析结果：与放疗前相比，NPC患者在接受放疗后，fMN-BNLs迅速显著增高。当累积放疗剂量从0Gy增至50Gy时，fMN-BNLs的平均值从12.9±4.2‰增至141±20.1‰，显示出良好的剂量-反应关系，应用SPSS11.0进行曲线拟合得到的曲线方程为：Y= 12.3458 + 10.6107X - 0.3095X2+ 0.0030X3（R=0.889，P<0.01），证实利用fMN-BNLs可以较好地对辐射的生物剂量进行评估。2、流式仪检测大鼠骨髓MNPCE与MNNCE：经过对不同的检测参数的分析比较，<WP=9>最终确定以FL1（指示DNA荧光强度）为纵坐标，FSC（指示细胞大小）为横坐标能够很好地区分各个细胞群——总有核细胞（TNC）、嗜多染红细胞（PCE）、含微核的嗜多染红细胞（MNPCE）、正染红细胞（NCE）以及含微核的正染红细胞（MNNCE）。经CP处理24小时后，对应于不同的处理剂量0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg以及40mg/kg，大鼠骨髓fMNPCE分别为4.08±0.56‰、10.60±2.74‰、16.30±4.00‰以及20.05±4.40‰；经CP处理48小时后，对应于不同的处理剂量0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg以及40mg/kg，大鼠骨髓fMNPCE分别为4.50±1.52‰、12.20±3.78‰、23.23±3.62‰以及40.98±6.65‰，结果显示出良好的剂量-反应以及时间-反应关系。3、流式仪检测结果与人工镜检结果的比较：两种方法检测的结果均呈现良好的剂量-反应以及时间-反应关系，但流式仪检测结果略高于人工镜检结果，统计分析显示两种方法检测的结果之间没有显著差异，并且二者之间具有良好的相关性（R=0.967）。据此认为基于单激光流式细胞仪的微核自动化检测体系得以成功建立。4、磁式细胞分选术分离富集效果：共对7例健康志愿者及10例NPC患者在接受不同累积放疗剂量后的外周血中的CD71抗原阳性的网织红细胞（Trf-Ret）进行了富集分离，结果表明，同一健康志愿者在不同时间利用该法分离富集到的Trf-Ret产量几乎没有差异，并证实该方法具有简单、可靠，重复性好的特点。不同个体间Trf-Ret的产量差异很大，在20%-90%之间，但这并非分离方法所致，而是个体差异造成，如年龄，性别等。5、人外周血MN-Trf-Ret自动化检测体系的建立：经反复摸索，成功建立了适用于人外周血MN-Trf-Ret的基于单激光流式细胞仪的自动化检测体系。对10例NPC患者及7例健康志愿者的fMN-Trf-Ret进行了检测，结果，NPC患者接受放疗后，fMN-Trf-Ret快速显著增高，在累积放疗剂量达到20Gy附近时，fMN-Trf-Ret达到最高水平，随着累积放疗剂量的继续增加，fMN-Trf-Ret一直处于高平台水平。对应于不同的累积放疗剂量0Gy、4Gy、10Gy、20Gy、30Gy、40Gy以及50Gy，fMN-Trf-Ret的平均值分别为2.97±0.72‰、29.37±4.47‰、57.90±12.41‰、69.05±11.43‰、62.58±16.36‰、51.19±11.34‰以及50.07±12.26‰。6、作为生物剂量仪的曲线拟合方程：在已获得的fMN-Trf-Ret与累计放疗剂量的量效以及时效反应关系基础上，经SPSS11.0拟合的最佳曲线方程为Y=3.0410＋7.8181X－0.2795X2＋0.0028X3（R=0.801，P＜0.01），初步认为在0Gy-50Gy剂量范围内，可尝试利用该方程对辐射事故中的辐射伤员的受照生物剂量进行评估和进一步验证。本研究建立的网织红细胞富集分离和快速流式仪?