【摘 要】
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目的建立HPV16型E6基因沉默的细胞克隆,探讨E6基因沉默后宫颈癌细胞系SiHa细胞的生物学性状。方法1、构建逆转录病毒载体,表达靶向HPV16~+E6基因的siRNA。2、脂质体法将重组逆
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目的建立HPV16型E6基因沉默的细胞克隆,探讨E6基因沉默后宫颈癌细胞系SiHa细胞的生物学性状。方法1、构建逆转录病毒载体,表达靶向HPV16~+E6基因的siRNA。2、脂质体法将重组逆转录病毒载体转染入包装细胞PA317,荧光显微镜下观察荧光,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆。3、收集病毒颗粒感染靶细胞SiHa,G418筛选获得E6基因持久沉默的SiHa细胞克隆。实验分4组:克隆形成后传代2次、15次、25次组和未感染组。4、RT-PCR检测E6基因沉默的SiHa细胞E6 mRNA的表达。5、流式细胞术检测E6基因沉默的SiHa细胞周期阻滞和凋亡变化。6、细胞增殖实验检测E6基因沉默的SiHa细胞增殖力。结果1、成功构建逆转录病毒载体,表达靶向HPV16~+E6基因的siRNA。2、将重组逆转录病毒载体转染入包装细胞PA317,获及稳定产生逆转录病毒的PA317细胞克隆。3、靶细胞SiHa感染逆转录病毒后,稳定表达E6 siRNA,建立HPV16~+E6基因沉默的细胞克隆。4、RT-PCR结果显示,克隆形成后传代2次、15次、25次组的E6 mRNA相对含量分别为0.35±0.001、0.71±0.001、0.96±0.005,与未感染组1.07±0.002比较及各克隆组间比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。5、流式细胞术示,克隆细胞凋亡率增加,G1期比例增高,S期比例降低。克隆形成后传代2次、15次、25次组凋亡率分别为11.3%,7.7%,5.7%,与未感染组1.8%相比,差异有统计学意义(P<0.01),各克隆组间相比差异有统计学意义(P<0.01);G1期细胞分别占72.5%、62.5%、55.6%,S期细胞分别占5.5%、10.1%、22.9%,与未感染组(G1期51.9%、S期36.9%)相比及各克隆组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。6、细胞增值实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立HPV16~+E6基因沉默的细胞克隆,特异性的siRNA能抑制细胞生长、E6mRNA表达,诱导细胞地凋亡,针对HPV16~+E6的siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。
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