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目的:调查北京地区五家教学医院临床分离的铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)对抗菌药物的耐药性;对碳青霉烯类耐药的PA进行分子流行病学研究;研究PA对碳青霉烯类耐药的分子机制,了解β-内酰胺酶、孔道蛋白OprD2在多重耐药铜绿假单胞菌(MDRP)中所起的作用;了解抗生素选择压力下PA的耐药性变化。
方法:首先回顾性总结北京朝阳医院2003~2005年临床分离PA的嗣药状况。然后收集2004.6~2005.12北京地区五家教学医院临床分离的非重复性213株对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌(IPPA),采用琼脂稀释法测定美罗培南、亚胺培南等抗菌药物对这些菌株的最低抑菌浓度(MIC);同时采用随机引物多态性DNA(RAPD)分型对213株IRPA中的121株MDRP进行分子流行病学研究,确定这121株MDRP的亲缘关系;研究213株IPPA对碳青霉烯类耐药机制;采用纸片法初筛产β-内酰胺酶菌株,利用三维试验确定酶的类型;利用接合试验检测耐药基因能否转移;对碳青霉烯酶IMP-、VIM-基因、β-内酰胺酶PER-1、VEB-1基因、质粒介导mnpC酶基因以及孔道蛋白OprD2基因进行聚合酶链式反应(PCR)及序列分析。体外在亚MIC浓度亚胺培南的环境中,对4株亚胺培南敏感株及铜绿假单胞菌ATCC27853进行耐药突变子筛选,了解亚MIC浓度亚胺培南的环境中,PA能否发生耐药突变?突变子的耐药机制是什么?去除亚胺培南压力因素后,突变子可否恢复敏感性?同时对北京朝阳医院的部分病例进行回顾性分析。
结果:北京朝阳医院2003~2005年临床分离PA对亚胺培南敏感性明显降低,从2003年的70.2%降至2005年的55.0%。五家教学医院均发现IRPA的克隆株流行,但这些医院流行的耐药克隆株遗传背景不同。213株IRPA中84株存在OprD2缺失,其中多数菌株可产不同类型的β-内酰胺酶:19株产金属酶IMP-1,2株产金属酶VIM-2,1株产DHA-1型质粒介导AmpC酶,30株产PER-1型超广谱β-内酰胺酶。接合试验未能将PA携带的这些耐药基因成功转入大肠埃希菌C600,但通过接合试验将大肠埃希菌携带的DHA-1基因成功的转入PA敏感株中。体外在亚MIC浓度亚胺培南的环境中,从4株亚胺培南敏感株及铜绿假单胞菌ATCC27853选择出对亚胺培南耐药的突变子。突变子均发现了孔道蛋白OprD2突变。
结论:北京朝阳医院2003~2005年临床分离PA对亚胺培南敏感性降低趋势明显,2005年l~9月SICU病房分离的PA对亚胺培南敏感率是24.4%,明显低于文献报道。这除了与抗菌药物的使用有关外,还与SICU病房出现的暴发流行密切相关。因此,除了规范使用抗菌药物外,在医院内积极采取有效的感染监测、预防及控制措施是十分必要的。北京地区五家教学医院均发现有IRPA的克隆株,并发生了不同程度的暴发流行。医院间未能发现遗传背景相同的流行耐药克隆。孔道蛋白OprD2缺失、产多种β-内酰胺酶(特别是IMP-1型金属酶和PER-1型ESBLs)是北京地区PA对碳青霉烯类耐药的主要机制之一。体外在亚MIC浓度的亚胺培南选择压力下,对亚胺培南敏感的PA由于出现了孔道蛋白OprD2突变而对亚胺培南耐药,并且耐药性十分稳定。通过病例回顾性分析也发现了PA在体内亚胺培南选择性压力下发生耐药突变的病例。提示PA感染患者在应用抗菌药物治疗过程中,应对致病菌进行连续分离、鉴定及敏感性测试,随时观察其耐药性变化,以便调整用药方案。PA不易通过质粒将其耐药基因传给其他细菌,但易通过质粒接受其他细菌的耐药基因。所以,在PA与其他细菌混合感染的病例中应密切对PA的耐药性变化进行监控。