【摘 要】
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研究背景:根据流行病学调查,心血管疾病是威胁人类健康的首位疾病。心肌肥大是心脏应对长期压力负荷的一种代偿形式。如果病因不能被消除,则出现失代偿,最终导致心衰。心脏需要大量ATP去维持其泵血功能,线粒体是其主要的供能细胞器。心脏在压力负荷条件下,会处于一种缺氧的状态,线粒体会受到一定程度的损伤。线粒体自噬的主要功能是识别和清除功能障碍及损伤的线粒体,是一种选择性自噬。已有研究表明H2S可以通过调控自
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研究背景:根据流行病学调查,心血管疾病是威胁人类健康的首位疾病。心肌肥大是心脏应对长期压力负荷的一种代偿形式。如果病因不能被消除,则出现失代偿,最终导致心衰。心脏需要大量ATP去维持其泵血功能,线粒体是其主要的供能细胞器。心脏在压力负荷条件下,会处于一种缺氧的状态,线粒体会受到一定程度的损伤。线粒体自噬的主要功能是识别和清除功能障碍及损伤的线粒体,是一种选择性自噬。已有研究表明H2S可以通过调控自噬,保护心脏。H2S与蛋白反应,将蛋白上氨基酸的巯基（-SH）修饰为-SSH,进而激活蛋白质发挥生物功能。ATG4是自噬小体形成过程中,发挥关键作用的半胱氨酸蛋白酶,富含巯基基团。H2S对ATG4进行巯基化修饰进而调控线粒体自噬,尚未证明。研究目的:探索H2S通过调控线粒体自噬在心肌肥大中的作用。研究方法:1.利用血管紧张素2（AngⅡ）构建心肌肥大的体外模型,qPCR检测ANP、BNP等肥大基因的表达;主动弓缩窄手术（TAC）构建心肌肥大的体内模型,超声心动图检测心功能。2.通过慢病毒感染细胞构建CSE（H2S代谢酶）过表达和敲低的H9C2细胞系,CRISPR/Cas9技术构建CSE敲除小鼠,Western Blot实验检测过表达和敲低水平。3.免疫荧光和免疫组化实验检测细胞中的H2S水平、ROS水平、线粒体ROS水平以及细胞的肥大、坏死、凋亡以及氧化应激情况。4.Western Blot检测自噬、自噬流、线粒体自噬水平以及ATG4家族的蛋白表达水平。实验结果:1.qPCR和超声心动图实验结果显示:心肌肥大的体外和体内模型构建成功。2.Western Blot实验结果显示:CSE过表达和敲低H9C2细胞系构建成功。3.免疫荧光实验结果显示:在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程,对照组的H2S水平降低,ROS水平增高,心肌细胞面积增大;过表达CSE组的H2S水平增高,ROS水平降低,心肌细胞面积无显著性变化;敲低CSE组的H2S水平降低,ROS水平增高且高于对照组,心肌细胞面积增大且大于对照组。4.免疫组化实验结果显示:CSE敲除会促进小鼠心脏肥大以及心肌细胞的肥大、坏死、凋亡以及氧化应激水平。5.Western Blot结果显示:在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程,对照组自噬水平降低;过表达CSE组自噬水平无显著性变化;敲低CSE组自噬水平降低且低于对照组;自噬流正常。6.荧光染色和Western Blot结果显示:在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程,对照组线粒体ROS水平增加,线粒体自噬水平降低;过表达CSE组线粒体ROS水平和线粒体自噬水平均无显著性变化;敲低CSE组线粒体ROS水平增加且高于对照组,线粒体自噬水平降低且低于对照组。7.Western Blot实验结果显示:在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程,对照组ATG4A水平降低,ATG4B、C、D均无显著性变化;过表达CSE组ATG4A、B、C、D均无显著性变化;敲低CSE组ATG4A自噬水平降低且低于对照组,ATG4B、C、D均无显著性变化。结论:1.在心肌肥大过程中,细胞会发生应激反应,包括H2S水平的下降,ROS的增多。敲低CSE即降低内源性H2S水平会增加心肌细胞肥大和氧化应激情况;过表达CSE即增加内源性H2S的水平可以缓解细胞的肥大和氧化情况。2.在心肌肥大过程中,过表达CSE即增加内源性H2S水平,内源性H2S对自噬进行正调控,进而减轻心肌细胞肥大程度。3.在心肌肥大过程中,线粒体受到损伤,线粒体ROS增多,引发线粒体自噬,内源性H2S对线粒体自噬进行正调控,保护线粒体,进而减轻心肌细胞肥大程度。4.在心肌肥大过程中,H2S主要通过调控ATG4A参与自噬小体形成并影响自噬功能,进而起到对心肌肥大的调控作用,保护心脏。
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