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背景NK/T细胞淋巴瘤(Natural Killer/T cell lymphoma,NK/Tcl)是一类预后较差的非霍奇金淋巴瘤亚型,大部分来源于成熟的NK细胞,少部分来源于NK样T细胞,细胞表型具有高度异质性、复杂多样性。NK/Tcl好发于上呼吸道及消化道,临床表现各异,进展迅速,频繁复发,但诊疗进展缓慢。目前还缺乏更加有效的治疗靶点。MicroRNA(miRNA)是非编码RNA的重要组成部分,通过RNA的降解和(或)抑制翻译来调控基因表达。miRNA在肿瘤细胞和肿瘤细胞微环境的联系间起着重要作用,通过调控各种分子信号通路,释放肿瘤细胞因子或生长因子,从而调控肿瘤的发生发展。研究发现,部分miRNA在特定肿瘤中可发挥癌基因和抑癌基因的功能。MiR-148a是miR-148/miR-152家族的成员,该家族是由三个高度保守的、成熟的miRNA组成,分为miR-148a、miR-148b及miR-152。miR-148a是一种新型的肌源性miRNA,可通过作用于靶蛋白ROCK1促进成肌细胞和骨骼肌细胞分化。同时,miR-148a可作用于不同的靶基因发挥其在各种肿瘤中的功能。近年来研究发现,miR-148a在胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌中均检测到表达下调,而在骨肉瘤中的表达上调。且发现miR-148a在不同肿瘤细胞中可发挥癌基因或抑癌基因作用。而目前有关miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤中的作用无相关研究的报道,本文拟对miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤中的生物学功能进行研究。目的鉴于miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞中无相关研究报道。本文拟以体外实验方法对miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞的表达及功能进行研究。进一步阐明miR-148a-3p功能并以寻找NK/T细胞淋巴瘤新的治疗靶点。方法1.NK/T细胞淋巴瘤细胞株NK92细胞及YT细胞均由淋巴瘤重点实验室(张明智,郑州大学第一附属医院肿瘤科)馈赠,正常人NK细胞株购于中国科学院细胞库。以慢病毒为介导的LV3-miR-148a-3p mimics过表达及LV3-miR-148a-3p inhibitor干扰载体购于上海吉玛公司。2.利用qRT-PCR方法检测miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞NK92细胞、YT细胞及正常人NK细胞中的表达情况。3.以慢病毒为介导的过表达载体(LV3-miR-148a-3p mimics)、敲除载体(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)分别感染YT细胞、NK92细胞,感染后检测miR-148a-3p的表达情况及YT、NK92细胞增殖能力、细胞迁移能力、细胞侵袭能力、细胞凋亡的影响。4.SPSS 21.0软件进行统计学分析。miR-148a-3p的相对表达量三组细胞间均数的比较采用单因素方差分析。得出结果用均值±标准差表示。当P<0.05时,可认为样本间的差异具有统计学意义。所有实验至少重复3-5次。结果1.MiR-148a-3p在正常NK细胞、YT细胞、NK92细胞中的相对表达量分别为8.62±0.35、14.55±0.27、24.48±0.44,NK92细胞中的相对表达量显著高于其它两组细胞(P<0.05)。miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞中表达明显升高,NK92细胞表达量约是对照组3倍,YT细胞的表达量约是对照组的1.7倍(P<0.05)。2.用各修饰慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤的YT细胞后,检测敲除组(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)、过表达组(miR-148a-3p)、阴性对照组(LV3-NC)的相对表达量分别是4.84±0.4、21.55±0.33、10.01±0.69,与敲除组、阴性对照组比较,过表达组在YT细胞中表达显著升高(P<0.05)。用各修饰慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤的NK92细胞后,检测敲除组(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)、过表达组(miR-148a-3p)、阴性对照组(LV3-NC)相对表达量分别是8.44±0.3、31.13±0.52、11.11±0.5,与过表达组、对照组比较,敲除组在NK92细胞中表达显著降低(P<0.05)。3.CCK-8检测miR-148a-3p对YT、NK92细胞增殖活性的影响,过表达组(miR-148a-3p)与阴性对照组(LV3-NC)比较,过表达组细胞增殖活性明显升高,敲除组(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)与阴性对照组(LV3-NC)比较,敲除组细胞增殖活性明显降低。4.Transwell小室检测miR-148a-3p对YT、NK92细胞迁移能力的影响。过表达组(miR-148a-3p)与敲除组(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)、对照组(LV3-NC)比较,过表达组细胞的迁移能力显著升高。5.Transwell小室铺基质胶检测miR-148a-3p对YT、NK92细胞侵袭功能的影响。过表达组(miR-148a-3p)与敲除组(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)、对照组(LV3-NC)比较,过表达组细胞的侵袭能力显著升高。6.利用Annexin V-PE/7-AAD双染法检测miR-148a-3p对NK/T细胞淋巴瘤细胞系凋亡的影响。在YT细胞中,敲除组(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)、过表达组(miR-148a-3p)、阴性对照组(LV3-NC)细胞凋亡比例分别为14.2±0.84%,2±0.5%,5.2±0.57%,结果表明,敲除组LV3/anti-has-miR-148a-3p感染YT细胞后,细胞凋亡比例显著增加;在NK92细胞中,敲除组(LV3/anti-hsa-miR-148a-3p)、过表达组(miR-148a-3p)、阴性对照组(LV3-NC)细胞凋亡比例分别为54.8±3.96%,43.4±0.55%,44.1±1.08%,结果表明,敲除组LV3/anti-hsa-miR-148a-3p感染NK92后,细胞凋亡比例显著增高。在NK/T细胞淋巴瘤YT、NK92细胞中,LV3/anti-hsa-miR-148a-3p敲除组细胞凋亡比例显著增高,miR-148a-3p过表达组细胞总凋亡比例显著降低,敲除组细胞总凋亡比例显著升高(P<0.05)。结论1.MiR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞中表达显著升高,提示miR-148a-3p可能参与了NK/T细胞淋巴瘤的发生进展。2.抑制NK92细胞、YT细胞中miR-148a-3p的表达可抑制细胞增殖、迁移、侵袭及促进细胞凋亡,提示miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞中可发挥癌基因作用,并有望成为NK/T细胞淋巴瘤的新的治疗靶点。